过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的上调作用

目的:探讨过氧化氢诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的影响。方法:分别选择0,100,300μmol/L过氧化氢作用ARPE-19细胞4h后收集样本,Western blot方法检测细胞中20S蛋白酶体表达水平,细胞免疫荧光方法检测20S蛋白酶体在细胞中的分布。结果:100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞中20S蛋白酶体的表达和对照组相比明显增加(100μmol/L过氧化氢处理组vs0和300μmol/L过氧化氢处理组,P<0.05),并呈现剂量依赖性。正常培养情况下,细胞内20S蛋白酶体在核周微量表达,100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞内20S蛋白酶体和对照组相比明显增加,其分布集中在核内及核膜周围。结论:过氧化氢对ARPE-19的20S蛋白酶体表达有上调作用。     

ROS/NLRP3/Caspase-1信号通路在高糖诱导视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含Pyrin结构域蛋白3(NLRP3)炎症小体在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞ARPE-19增生及凋亡中的作用及机制。方法:将体外培养的ARPE-19细胞分为正常对照组和高糖组,分别用常规培养液和含终浓度30 mmol/L葡萄糖培养液培养48 h,采用荧光探针检测各组细胞活性氧簇...     

小鼠睫状神经营养因子基因在视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞中表达的研究

目的探讨野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子（CNTF）基因的真核表达及其在视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞中目的蛋白的表达及意义。方法通过逆转录聚和酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列,体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA（cDNA）编码序列,构建上述两序列分别克隆至pTracer-CMV真核表达载体,转染ARPE-19细胞,免疫印迹检测两种CNTF的表达。通过噻唑蓝（MTT）和流式细胞仪定量凋亡检测观察两种CNTF基因在去血清培养的ARPE-19细胞中表达后产生的生物学效应。结果PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因,DNA序列分析证实两种真核表达载体中的CNTF序列与GeneBank中目的序列一致。两种重组真核表达质粒转染ARPE-19细胞后,免疫印迹检测结果证实CNTF在ARPE-19细胞培养上清中有表达。MTT检测结果显示CNTF不能促进ARPE-19细胞的增殖,流式细胞仪凋亡分析提示CNTF在一定程度上可以抑制去血清培养引起的ARPE-19细胞凋亡。结论野生型和截短型CNTF基因在ARPE-19细胞系的真核表达为视网膜色素变性基因治疗研究奠定了基础。     

过氧化氢诱导的氧化应激对ARPE-19细胞中泛素化途径的激活

目的探讨H2O2诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19细胞中泛素及泛素化蛋白表达的影响。方法MTT法建立H2O2诱导ARPE-19细胞模型。不同浓度H2O2作用于ARPE-19细胞后,RT-PCR检测细胞内泛素基因转录水平,细胞免疫荧光方法检测细胞内泛素化蛋白的表达。用有（或无）蛋白酶体抑制剂MG-132预处理后再用H2O2处理ARPE-19,Western blot方法检测细胞内泛素化蛋白。结果氧化应激后UBA、UBB的转录水平明显增加（P〈0．05）,UBC无明显变化。细胞内相对分子质量为50000～250000的泛素化蛋白均增加,MG-132预处理后再用H2O2处理,细胞内增加的泛素化蛋白则多集中在相对分子质量75000以上。细胞内泛素化蛋白表达增加,核内增加明显。结论H2O2诱导的ARPE-19氧化应激过程激活细胞内泛素化途径。     

姜黄素在抑制紫外线B诱导的人视网膜色素上皮细胞DNA氧化损伤和凋亡中的作用

目的 探讨姜黄素在紫外线B(UVB)诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞DNA氧化损伤和凋亡中的作用机制。方法 将人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19)随机分为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、姜黄素组、UVB照射组、UVB+DMSO组和UVB+姜黄素组。CCK-8实验检测姜黄素对UVB照射前后ARPE-19细胞活力的影响；免疫荧光检测DNA氧化损伤标志蛋白磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的定位；Western blot检测γH2AX、凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)和BCL-2相关X蛋白(BAX)]的表达变化；使用X-rosamine衍生物(Mito-Tracker Red CMXRos)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的钙离子依赖的磷脂结核蛋白Annexin V(Annexin V-FITC)来检测UVB诱导的ARPE-19细胞线粒体膜电位变化和细胞凋亡情况。结果 与空白对照组相比，DMSO组DMSO处理24 h后的ARPE-19细胞活力无明显改变(P>0.05)。与DMSO组相比，姜黄素组采用15μmol·L^-1姜黄素处理24 ...     

紫杉醇对视网膜色素上皮细胞功能的破坏及其潜在机制

目的:探究抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡、周期、形态和视网膜外屏障的潜在毒性作用。方法:体外培养ARPE-19细胞,将细胞分为对照组(正常培养基培养)、加药物组(PTX)。不同浓度PTX(0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理ARPE-19细胞12、24、36、48、72h,CCK8法检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞凋亡的影响及周期阻滞作用;免疫荧光观察细胞形态变化;Western blot检测凋亡相关蛋白表达及屏障功能相关蛋白表达;通过测量细胞跨上皮电阻检测药物对细胞屏障的影响。结果:PTX使ARPE-19细胞的增殖能力降低,0.005mg/L PTX处理36h,细胞增殖开始受影响;同时,PTX加速细胞凋亡且与时间、药物浓度呈依赖性,流式检测细胞周期可明显得出细胞被阻滞于G2-M期。0.05mg/L PTX处理24h后,细胞形态发生明显改变,正常细胞呈梭形或不规则形,加药物组中,细胞数相对减少且形态趋于圆形;0.05mg/L PTX破坏视网膜屏障功能,药物处理后细胞跨上皮电阻显著降低且紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达较对照组显著降低(P<0.05)。Cleaved-caspase-3、Bax的表达量较对照组显著增加,Bcl-2的表达量较对照显著降低(P<0.05)。结论:PTX对ARPE-19细胞的增殖、凋亡,且依赖与时间及浓度;此外,PTX对ARPE-19细胞周期及形态均产生影响。同时PTX可破坏视网膜的屏障功能,提示抗肿瘤药物存在对视网膜潜在的毒性作用。     

枸杞多糖对LPS诱导的人视网膜色素上皮细胞炎性反应的影响及机制

目的:探索枸杞多糖(LBP)对细菌脂多糖(LPS)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞的炎性反应的影响及其可能介导的信号通路。方法:通过LPS刺激体外培养的ARPE-19细胞构建炎性反应模型。将细胞随机分为5组,空白组使用完全培养基培养,LPS组给予含10μg/mL LPS的完全培养基刺激24h,低、中、高浓度LBP组分别给予0.1、0.5、1mg/mL LBP完全培养基孵育24h后给予含10μg/mL LPS的完全培养基刺激24h。应用CCK-8观察细胞存活率、实时荧光定量PCR检测相关炎性因子的mRNA表达量及Western-blot检测NF-κB/MAPK信号通路相关磷酸化蛋白表达量的变化。结果:与正常细胞相比,LPS刺激后,ARPE-19的存活率下降。同时,随着外源性LBP浓度增加,ARPE-19的细胞存活率升高,且细胞内炎性因子IL-1β、IL-6和MCP-1的表达量降低,并伴随NF-κB/MAPK通路的相关磷酸化蛋白(p-p65、p-IκBα、p-JNK、p-ERK及p-p38)的表达下降。结论:枸杞多糖通过抑制胞内炎性因子及NF-κB/MAPK通路相关因子的磷酸化,从而阻止LPS诱导人视网膜色素上皮细胞产生的炎性反应。     

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2表达的影响

目的 研究过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2（age-related maculopathy susceptibility 2,ARMS2）转录和蛋白水平的影响,初步探讨ARMS2基因在氧化应激中对视网膜色素上皮细胞的作用.方法 实验研究.选用ARPE-19细胞,以浓度为0、100、300、500、700μmol/L的H2O2作用一定时间后,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各浓度组H2O2作用2 h和4 h后ARPE-19细胞生长情况;采用Realtime-PCR（SYBR Green法）和细胞免疫荧光法检测ARMS2的转录及蛋白水平变化.组间比较均采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法,H2O2浓度与细胞活性的关系采用曲线估计分析.结果 五个浓度的H2O2作用ARPE-19细胞4 h后,吸光度值分别为0.531±0.037、0.370±0.017、0.371±0.016、0.330±0.006和0.297±0.012,差异有统计学意义（F=6.782,P=0.007）.曲线估计分析显示H2O2浓度与细胞活性呈高度负相关（r=-0.99.P=0.036）.100～700 μmol/L H2O2作用ARPE-19细胞后,Realtime-PCR结果 Ct值分别为1.154±0.007、1.324±0.022、1.350±0.011、1.280±0.031,差异有统计学意义（F=33.409.P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2基因mRNA表达量达到高峰,之后下降.细胞免疫荧光检测灰度值结果分别为7320±2493、14 300±848、22400±1596、23400±2405、19 200±561,差异有统计学意义（F=22.843,P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2蛋白表达量达到高峰,之后下降.转录和蛋白水平变化趋势一致.结论 H2O2在一定浓度范围内时,可诱导氧化应激,使ARPE-19细胞内ARMS2转录和蛋白水平增加,如果H2O2的浓度超过ARPE-19细胞耐受范围,ARMS2基因表达量下降.     

非接触共培养体系下抑制ARPE-19中CAMKⅡ表达对HUVECs迁移和侵袭及管腔形成的影响

目的:探讨非接触共培养体系下抑制人视网膜色素上皮细胞(ARPE)中Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)表达对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移、侵袭、管腔形成的影响。方法:将过表达CAMKⅡ-δ的ARPE-19样本进行RNA测序,应用生物信息学分析差异基因参与的功能。使用transwell小室构建ARPE-19和HUVECs非接触共培养体系,根据实验干预措施分为：空白组：仅接种未共培养的HUVECs,无ARPE-19细胞;对照组：ARPE-19和HUVECs细胞均使用完全培养基进行共培养;AIP组(CAMKⅡ抑制组):ARPE-19使用含有AIP(160 nmol/L)的完全培养基,HUVECs使用完全培养基,进行共培养。检测HUVECs迁移、侵袭和管腔形成能力的变化,并通过Western blotting检测CAMKⅡ/AMPK/mTOR/VEGFA蛋白表达水平。结果:生信分析发现差异基因参与细胞生长与死亡和细胞运动等生物学过程。划痕和transwell迁移实验均表明AIP组的HUVECs相对迁移率均明显低于对照组(均P<0.05)。而侵袭和...     

CERKL通过激活SIRT1/E2F1轴减轻蓝光导致的人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤

目的：探讨神经酰胺类似蛋白(CERKL)是否通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)/E2F转录因子1(E2F1)轴减轻蓝光导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤。

方法：培养人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞，蓝光照射后观察细胞形态变化，PCR与蛋白免疫印迹法测定细胞CERKL的表达情况； 分别采用siRNA-CERKL与pcDNA3.1-CERKL转染ARPE-19细胞，蓝光暴露处理后，采用MTT法测定细胞活力，TUNEL法检测细胞凋亡情况，分析氧化应激标志物的含量与SIRT1/E2F1轴的表达情况； 随后转染siRNA-SIRT1至ARPE-19细胞，再次测定蓝光照射下细胞氧化应激损伤状况。

结果：蓝光照射后，ARPE-19细胞逐渐收缩成圆球状，且出现空泡； 蓝光照射导致CERKL表达水平升高(P<0.05)，同时观察到细胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，活性氧、丙二醛与8-羟基脱氧鸟苷含量升高(P<0.05)； 沉默CERKL会加剧此现象，而上调CERKL则能缓解此变化(P<0.05)； 上调CERKL同时激活了SIRT1表达，促进了E2F1的脱乙酰化(P<0.05)，而沉默SIRT1能逆转上调CERKL对蓝光导致ARPE-19细胞氧化应激损伤的缓解作用(P<0.05)。

结论：CERKL通过激活SIRT1表达，促进E2F1脱乙酰化，从而减轻蓝光诱发的ARPE-19细胞氧化应激损伤。     

miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。

方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。

结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。

结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。     

Inhibition of cell proliferation, migration and apoptosis in blue-light illuminated human retinal pigment epithelium cells by down-regulation of HtrA1

AIM: To investigate the effect of HtrA1 on the proliferation, migration and apoptosis of human retinal pigment epithelium (RPE) cells in the light injured model, as well as the expression of the apoptosis related molecules. METHODS: The human RPE cell line ARPE-19 was exposed to blue light to establish the light injured model. The cells were transfected with HtrA1 siRNA to knockdown HtrA1 expression. Subsequent expression of HtrA1 was determined by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot, respectively. Changes in cell proliferation, migration and apoptosis were assessed by cell counting kit-8 (CCK-8), Transwell assay and flow cytometry respectively, as well as changes in the mRNA and protein levels of Bax, Caspase-3 and Bcl-2 expression. RESULTS: HtrA1 was highly expressed in ARPE-19 cells after blue light irradiation. Knockdown of HtrA1 expression inhibited the proliferation, migration and apoptosis of the blue-light-irradiated ARPE-19 cells (P<0.05). Bax and Caspase-3 expression were significantly reduced both at mRNA and protein levels (P<0.05) after siRNA treatment. Bcl-2 expression significantly increased in blue-light-irradiated ARPE-19 cells after siRNA interference (P<0.05). CONCLUSION: Silence of HtrA1 may inhibit the proliferation, migration and apoptosis of ARPE-19 cells in light injured model. Moreover, HtrA1 suppression in blue-light-irradiated ARPE-19 cells may ameliorate cell apoptosis through down-regulation of Bax and Caspase-3, and up-regulation of Bcl-2 expression.     

活性氧在贝伐单抗诱导视网膜色素上皮细胞上皮间质转化中的作用

目的　观察贝伐单抗（BEV）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤和上皮间质转化（EMT）的影响,进一步探讨抑制活性氧（ROS）在EMT中的作用。方法　选取人ARPE-19细胞株,根据实验需要将ARPE-19细胞分为4组:空白对照组、BEV组、BEV+NAC组和BEV+DPI组,其中空白对照组细胞不进行任何干预,BEV组用0.25 g?L^-1 BEV处理细胞72 h,另外两组在 BEV处理细胞24 h后分别再用ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI处理细胞48 h。采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色观察各组ARPE-19细胞内ROS和H₂O₂的生成堆积情况;细胞免疫荧光观察各组ARPE-19细胞中EMT标志物［紧密连接相关蛋白闭锁带蛋白-1（ZO-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（FN）］的表达情况;再通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞中EMT标志物的mRNA和蛋白的表达水平。结果　DCFH-DA染色观察发现,ARPE-19细胞加入BEV继续培养后,ROS和H₂O₂表达均明显上调（均为P＜0.05）。与空白对照组相比,BEV组EMT指标变化显著:上皮标志物ZO-1的表达降低,间质标志物α-SMA和FN的表达升高,两组间各指标相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）;与BEV组相比,BEV+NAC组和BEV+DPI组中各项指标mRNA表达变化显著,ZO-1上升至0.955±0.048、1.056±0.017,而α-SMA下降至0.982±0.165、1.058±0.165,此外FN表达（0.666±0.063、0.983±0.125）也显著降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。各种因子的蛋白表达变化趋势与其相应mRNA表达相一致,与单纯BEV组相比,ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI都显著改变了EMT标志物的表达,ZO-1蛋白相对表达量升高了0.195±0.010、0.770±0.175,而α-SMA下降了0.353±0.098、0.482±0.037,FN下降了0.528±0.161、0.612±0.134,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　ROS参与了BEV诱导的RPE细胞EMT,抑制ROS可减轻BEV诱导的人RPE细胞的 EMT程度。     

Bevacizumab modulates retinal pigment epithelial-to-mesenchymal transition via regulating Notch signaling

AIM: To investigate the effect of bevacizumab treatment on Notch signaling and the induction of epithelial-of-mesenchymal transition (EMT) in human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19) in vitro. METHODS: In vitro cultivated ARPE-19 cells were treated with 0.25 mg/mL bevacizumab for 12, 24, and 48h. Cell morphology changes were observed under an inverted microscope. The expression of zonula occludens-1 (ZO-1), vimentin and Notch-1 intracellular domain (NICD) was examined by immunofluorescence. The mRNA levels of ZO-1, α-SMA, Notch-1, Notch-2, Notch-4, Dll4, Jagged-1, RBP-Jk and Hes-1 expression were evaluated with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protein levels of α-SMA, NICD, Hes-1 and Dll-4 expression were examined with Western blot. RESULTS: Bevacizumab stimulation increased the expression of α-SMA and vimentin in ARPE-19 cells which changed into spindle-shaped fibroblast-like cells. Meanwhile, the mRNA expression of Hes-1 increased and the protein expression of Hes-1 and NICD also increased, which Notch signaling was activated. The mRNA expression of Notch-1, Jagged-1 and RBP-Jk increased at 48h, and while Dll4 mRNA and protein expression did not change after bevacizumab treatment. CONCLUSION: Jagged-1/Notch-1 signaling may play a critical role in bevacizumab-induced EMT in ARPE-19 cells, which provides a novel insight into the pathogenesis of intravitreal bevacizumab-associated complication.     

地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的　探究地塞米松（Dex）对脂多糖（LPS）诱导人视网膜色素上皮（HRPE）细胞炎症损伤及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影响。方法　体外培养ARPE-19细胞株,MMT法检测不同浓度Dex处理细胞24 h、48 h、74 h对LPS诱导ARPE-19细胞存活率的影响,确定Dex最佳处理浓度和时间。ARPE细胞随机分为:正常对照组（NC组）、LPS组（5 mg·L^-1 LPS）、Dex组（0.20 mol·L^-1 Dex）、Dex+LPS组（0.20 mol·L^-1 Dex+5 mg·L^-1 LPS）,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平,Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。结果　同一时间点,与NC组比较,LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低（均为P<0.05）,且随着Dex浓度增加,细胞存活率呈先升高后下降的趋势;0.20 mol·L^-1 Dex作用LPS诱导的ARPE-19细胞24 h时细胞存活率为(90.77±5.73)%,接近NC组,因此选用0.20 mol·L^-1Dex作用24 h用于后续实验。NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与NC组、Dex组比较,LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、 NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高,且Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于LPS组（均为P<0.05）。结论　Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路减轻LPS诱导的HRPE炎症损伤。