华蟾素对Raji/ADR细胞多药耐药的逆转作用及机制

本研究旨在探讨华蟾素对Raji/ADR细胞多药耐药的逆转作用及其机制.采用MTT法检测华蟾素对Raji及Raji/ADR细胞的生长抑制率、半数抑制浓度（IC50）、逆转阿霉素耐药倍数,并绘制生长抑制率曲线;应用RTPCR法测定MDR-1和MRP-1基因的转录;Western blot法和流式细胞术法测定P-gp、MRP-1蛋白的表达.结果表明：华蟾素对Raji及Raji/ADR细胞72 h增殖抑制率为75.6％和69.3％,IC50分别为3.9 mmol/L和4.6 mmol/L,逆转阿霉素耐药倍数为255.7倍.华蟾素作用于Raji/ADR前后,MDR-1和MRP-1基因转录水平明显下降（P＜0.05）,P-gp和MRP-1蛋白表达明显降低.结论华蟾素可逆转Raji/ADR细胞对阿霉素的耐药,其机制为通过转录途径下调P-gp和MRP-1蛋白的表达.华蟾素是一种有效的肿瘤多药耐药逆转剂.     

鼻咽低分化鳞癌细胞X射线照射后多药耐药基因的表达及功能

目的：检测鼻咽癌CNE2细胞射线照射前后多药耐药基因（mdr1基因）及其编码产物P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）的表达及其功能的变化。方法：利用RT-PCR、Westernblot和流式细胞仪检测CNE2细胞射线照射前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素的外排功能。结果：鼻咽癌CNE2细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达，对柔红霉素的摄取较射线照射前高。结论：鼻咽癌低分化鳞癌细胞CNE2射线照射后化疗敏感性增高，除了多药耐药机制外可能尚存在其他耐药机制。     

Bmi-1介导的K562/ADR细胞多药耐药机制

目的:观察Bmi-1基因沉默对白血病耐药细胞株K562/ADR耐药性的影响并初步探讨其机制。方法:将2种序列的Bmi-1小干扰RNA SiRNA转染到耐药细胞K562/ADR,检测Bmi-1基因m RNA和蛋白的表达以确定转染效果。检测Bmi-1基因沉默后耐药蛋白P-gp及其编码基因MDR1的表达情况,并采用流式细胞术检测细胞内阿霉素蓄积情况。检测Bmi-1基因沉默后NF-κB蛋白的表达变化;应用NF-κB抑制剂PDTC处理K562/ADR细胞抑制NF-κB活性后,检测P-gp蛋白的表达及其功能的变化。检测Bmi-1基因沉默后PTEN、AKT和p-AKT蛋白表达的变化。应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理K562/ADR细胞抑制p-AKT表达后,检测NF-κB和P-gp蛋白的表达。应用PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默后的细胞,检测AKT、p-AKT、NF-κB和P-gp蛋白的表达。以上mRNA表达用RT-PCR法检测,蛋白表达用Western blot法检测。结果:在mRNA水平和蛋白水平2种序列的小干扰RNA均使K562/ADR细胞Bmi-1基因表达降低。MDR1/P-gp在Bmi-1 siRNA干扰细胞中的表达明显低于在K562/ADR细胞的表达(P0.05);干扰后细胞内阿霉素蓄积增多。Bmi-1基因沉默后,细胞NF-κB活性降低;NF-κB抑制剂抑制NF-κB活性后,K562/ADR细胞P-gp蛋白表达及药物泵出功能被抑制。Bmi-1基因沉默后PTEN蛋白表达增高,而p-AKT蛋白表达明显降低(P0.05)。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002抑制p-AKT表达后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达明显下降(P0.05)。PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默细胞后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达得到重塑。结论:Bmi-1在MDR1/P-gp介导的K562/ADR细胞多药耐药中起关键作用,这种作用可能是通过激活PTEN/AKT途径调控NF-κB完成。     

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。     

鼠尾草酸逆转K562/A02细胞多药耐药的机制研究

目的 探讨鼠尾草酸(Canosic acid,CA)对人类白血病多药耐药(MDR)细胞系K562/A02细胞的逆转作用及机制.方法 MTT法测定CA作用前后K562/A02细胞对阿霉素(ADM)的敏感性.流式细胞术(FCM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定细胞内ADM的平均荧光强度,计算细胞内ADM浓度.半定量RT-PCR检测细胞mdr1 mRNA表达水平.采用流式细胞术和Western blot 检测细胞膜P糖蛋白(P-gp)表达.结果 CA可将ADM对K562/A02细胞的IC50值由16.31μg/ml降至1.35μg/ml,逆转倍数为12.08倍.流式细胞术检测结果表明CA可将K562/A02细胞内ADM的荧光强度由17.05提高到60.53(P<0.01).LSCM结果显示CA可恢复ADM在K562/A02细胞的细胞核和胞质中的弥散分布,并使细胞内ADM的浓度由4.9 Oμg/ml提高至15.4μg/ml.RT-PCR结果显示K562/A02细胞mdr1 mRNA水平明显高于K562细胞,CA处理后K562/A02细胞mdr1 mRNA水平明显降低(P<0.01).流式细胞术检测K562/A02细胞膜上P-gp的荧光强度在经CA处理后由44.40降至22.80(P<0.05).Western blot结果显示CA处理后的K562/A02细胞膜上P-gp的表达明显降低.结论 在体外,CA可有效逆转人白血病细胞K562/A02的MDR,其逆转耐药的机制可能与P-gp蛋白表达下调并抑制其功能有关.     

靶向沉默HuR基因增强人肝癌细胞Hep3B对多柔比星的化疗敏感性

目的探讨沉默人抗原R(Hu R)基因对人肝癌细胞Hep3B多柔比星化疗敏感性的影响及相关机制。方法脂质体包裹靶向Hu R基因的短发夹RNA(sh RNA)转染Hep3B细胞,real-time PCR和Western blot分别检测沉默Hu R基因后Hu R、MDR1 m RNA和蛋白的表达,MTT法检测沉默Hu R基因后Hep3B细胞对多柔比星化疗的敏感性,流式细胞术(FCM)检测沉默Hu R基因后对Hep3B细胞凋亡的影响。结果 Hu R sh RNA质粒转染Hep3B细胞能有效沉默Hu R基因,m RNA和蛋白水平的抑制率分别为82%和75%。与未处理Hep3B细胞(Mock组)比较,沉默Hu R基因的Hep3B细胞(si Hu R组)对多柔比星的半数抑制浓度(IC50)显著降低[(86.36±6.54)μg/L vs.(318.56±9.89)μg/L,P<0.05],细胞凋亡率明显升高[(30.48±5.12)%vs.(8.86±1.35)%,P<0.05],MDR1 m RNA和P-gp蛋白表达显著降低,比值分别为0.36±0.08和0.28±0.11,差异均有统计学意义(P<0.05)。Mock组与转染对照sh RNA质粒Hep3B(Control组)的各检测指标均无统计学差异(P>0.05)。结论沉默Hu R基因可能通过抑制耐药蛋白P-gp的表达增强其对多柔比星的化疗敏感性。     

端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响

目的探讨人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸(hTERT ASODN)对乳腺癌MCF-7细胞系干细胞微球体富集及其生物学特性的影响。方法以人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染,以正义序列转染作为对照。实验分设转染组(ASODN组),正义序列转染的对照组(SODN组)及空白对照组。采用无血清悬浮培养法观察转染对MCF-7干细胞微球体富集的影响。Western blot检测各组干性标记物CD44及ALDH1的表达。RT-PCR检测各组ABCG2、MDR1 mRNA的表达。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学处理。结果 ASODN组干细胞微球体生长速率及球体体积明显差于两对照组。与空白对照及SODN组比较,Western blot检测发现CD44与ALDH1在ASODN组细胞表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR检测发现,在ASODN组细胞ABCG2及MDR1 mRNA的表达量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。而空白对照组及SODN组两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hTERT ASODN在抑制乳腺癌干细胞微球体的富集、降低乳腺癌细胞干性表达及其耐药性方面具有重要作用。     

多药耐药基因MDR1转染胎盘源间充质干细胞的研究

目的 将全长外源多药耐药基因转入间充质干细胞使其外源基因得以表达。方法 从胎盘组织中分离培养间充质干细胞，构建携带全长外源多药耐药基因的逆转录病毒，将此逆转录病毒转染间充质干细胞，绿色荧光显微镜检测外源基因的表达，westem blot检测MDR1基因表达产物。结果 绿色荧光显微镜可观测到转染后间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达，westem blot检测到全长多药耐药基因编码的p-糖蛋白的表达。结论 mdr1逆转录病毒载体可有效转染人胎盘源MSC，转染的外源基因可充分表达。     

发夹状siRNA逆转白血病K562/A02细胞株mdr1和GSTπ功能的研究

目的研究发夹状小分子干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02多药耐药基因(mdr1)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTπ)基因功能的影响。方法以 mdr1 mRNA第79-99和GSTπ mRNA第308-327核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的发夹状 siRNA,克隆入pSilencer2．1-U6 neo,克隆产物为pSilence mdr1和pSilence GSTπ,转染K562/A02细胞株。用Western blot和荧光免疫组化法观察P糖蛋白(P-gp)和GSTπ蛋白的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50)。结果 Western blot检测显示转染pSilence mdr1和pSilence GSTπ的K562/A02细胞株与K562/A02细胞对照组相比,P-gp和GSTπ的表达明显下降,分别从0．75 ±0．02和0．54±0．02下降到0．48±0．05和0．39±0．02(P值均<0．01),α-微管蛋白的表达没有变化;转染pSilence核纤层蛋白A/C的K562/A02细胞株与对照组相比,核纤层蛋白A/C表达明显下降,但P-gp和GSTπ的表达不变;荧光免疫组化显示P-gp和GSTπ阳性细胞比例从转染前的(71．25± 9．65)％和(81．25±6．49)％下降到转染后的(35．25±5:97)％和(41．25±4．43)％(P值均<0．01); 转染空载体后K562/A02细胞对阿霉素的耐药指数为23,转染pSilence mdr1和pSilence GSTπ后分别下降为8和10,差异有统计学意义(P<0．01),结论 siRNA可有效、特异地逆转K562/A02细胞株 mdr1和GSTπ的多药耐药性。     

WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

Notch1 siRNA对骨髓瘤细胞硼替佐米药物敏感性的影响

目的探讨Notch1 siRNA对体内外人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞硼替佐米药物敏感性的影响。方法体外采用Notch1 siRNA转染RPMI-8226细胞,CCK-8实验检测细胞增殖及硼替佐米药物的敏感性;Western blot检测各组细胞Notch1蛋白表达变化;将RPMI-8226细胞皮下注射于NOD/SCID小鼠,建立人多发性骨髓瘤(MM)小鼠移植瘤模型,将成瘤小鼠分为三组:NS+bortezomib(Notch1 siRNA转染联合硼替佐米)组;CS+bortezomib(Control siRNA转染联合硼替佐米)组;UN+bortezomib(硼替佐米)组,观察各组肿瘤体积变化,免疫组化染色法观察Notch1变化,TUNEL法检测细胞凋亡。结果 Notch1 siRNA有效下调骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞Notch1蛋白表达;Notch1 siRNA在96 h抑制细胞增殖作用明显增加,与CS及UN组比较对细胞增殖的作用可见明显差异(P<0.01);Notch1 siRNA转染组细胞对硼替佐米IC50值为1.21μmol/L,与Control siRNA转染组及未转染组相比均存在统计学差异(P<0.01);Notch1 siRNA降低移植瘤Notch1蛋白表达,Notch1 siRNA转染组细胞的AI明显高于Control siRNA转染组及未转染组(P<0.01);Notch1 siRNA转染联合硼替佐米组肿瘤体积明显减小,13、17及21 d与Control siRNA转染联合硼替佐米组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论体外实验Notch siRNA抑制人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞增殖增加硼替佐米的敏感性,体内试验证实Notch siRNA联合硼替佐米可以明显减小荷瘤MM小鼠肿瘤体积、增加凋亡,提示Notchl是治疗MM的有效分子靶点。     

沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE1细胞增殖和凋亡的研究

目的：探讨 Survivin表达降低时,对鼻咽癌细胞的增殖及凋亡的影响。方法运用 RNA 干扰技术,结合 RT-PCR,Western blot技术,观察干扰 Survivin效果。干扰 Survivn后用 MTT法和 TUNEL法检测鼻咽癌细胞增殖,凋亡的情况。用 Western-blot方法检测凋亡相关蛋白 PARP,Bcl-2和Bax的表达。结果 RT-PCR检测显示 Survivin-siRNA干扰组,Survivin mRNA表达明显下调,其相对表达量为0.26±0.02,抑制率为43.7％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;Western blot检测显示 Survivin-siRNA组蛋白表达下调,其蛋白相对表达量下降了57％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT检测显示 Survivin-siRNA组对细胞增殖有明显抑制作用,在24,48和72 h的抑制率分别为21.9％,37.1％和29.6％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;Tunel染色结果显示 Survivin-siRNA组细胞凋亡数明显增高。Western blot结果显示Survivin-siRNA组凋亡蛋白PARP（89KD）显著升高,为对照组的3.9倍,抑制凋亡蛋白Bcl-2降低,降低了70％,促进凋亡蛋白Bax升高,为对照组的2.4倍;同时也抑制AKT的磷酸化,磷酸化水平降低了57％,与对照组相比以上结果差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论干扰 Survivin表达,抑制鼻咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡。Survivin基因可成为鼻咽癌基因治疗的一个潜在靶点。     

Apo-2L对放射线诱导鼻咽癌CNE细胞凋亡作用

目的了解凋亡素2配体（Apo-2L）与放射治疗协同对体外培养鼻咽癌CNE细胞增殖周期及凋亡率的影响。方法 MTT法检测不同浓度Apo-2L对鼻咽癌CNE细胞的影响,确定Apo-2L与细胞作用时间及浓度。将细胞随机分为对照组、Apo-2L组、Apo-2L＋放射组及单纯放射组,分别给予相应的处理后制成细胞悬液,流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞周期变化。结果鼻咽癌CNE细胞的抑制率与Apo-2L的浓度呈正相关（r=0.91,P〈0.05）,当用浓度为100μg/L的Apo-2L处理CNE细胞24h,Apo-2L＋放射组凋亡率较其他各组明显升高,差异有显著性（F=8.64,P〈0.05）。Apo-2L＋放射组G2-M期比率较其他各组显著降低（F=7.74,P〈0.05）。结论Apo-2L对体外培养鼻咽癌CNE细胞有抑制增殖和促进凋亡作用;Apo-2L联合放射线治疗可以使细胞周期同步化,并明显提高CNE细胞的凋亡率。     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的探讨应用化学修饰的小干扰RNA（siRNA）沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）基因对移植瘤生长的影响。方法将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时,随机分为对照（A）组、转染试剂对照（B）组、siRNA治疗（C）组。于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000^TM转染试剂和Lipofectamine 2000^TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA。22d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT—PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1基因的表达。结果与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制（F=158．18、55．72,q=11．39、14．05,P〈0．01）;RTPCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385．06,q=33．43,34．52,P〈0．01）;蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达（F=114．11,q=9．31,20．75,P〈0．01）。A组和B组各指标差异无显著性（P〉0．05）。结论化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达,抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

双靶向性小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2的放射增敏作用

目的研究ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用。方法采用MTT法测定ZD6474的半数抑制浓度（50％inhibition concentration,IC50）,克隆形成实验计算细胞存活率,拟合生存曲线计算放射生物学参数,流式细胞仪检测ZD6474联合放疗的凋亡率及细胞周期分布。结果单纯用药组,CNE2细胞的存活率随ZD6474浓度的增加而降低,其IC50约为2．15μmol·L^-1。ZD6474作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用,增敏比为1．535±0．134。ZD6474或照射均可增加凋亡率,减少S期细胞比例及增加G2／M期细胞比例（P〈0．01）。结论ZD6474联合照射应用可提高cNE2细胞的放射敏感性并阻碍细胞增殖、促进凋亡和干扰细胞周期分布。ZD6474有望成为EGFR高表达CNE2细胞的放射增敏剂。     

下调STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究。方法:人腺样囊性癌生长细胞株ACC 2常规培养,分别采用A组为空白转染组,B组转染阴性对照siRNA(NC),C组转染特异性的siRNA(siRNA组)转染进ACC2,采用qRT PCR和Western blot法检测转染后STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT检测转染后腺样囊性癌细胞增殖。结果:ACC2细胞转染STAT3 siRNA 48 h后,STAT3 mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。ACC 2生长72 h细胞转染后细胞增殖受到抑制,较对照组有显著性差异(P0.05)。结论:STAT3基因有可能成为腺样囊性癌细胞生长基因治疗中重要的靶基因。     

抑制核小体结合蛋白对人膀胱癌细胞增殖的影响

目的探讨核小体结合蛋白（NSBPI）对人膀胱癌细胞增殖的影响。方法采用脂质体转染法将NSBP1基因转入膀胱癌EJ细胞系,分别通过CCK8、流式细胞仪、Real—TimePCR及Westernblot法观察EJ细胞的增殖,细胞周期时相的分布、凋亡以及CyclinDl、CyclinBl、Bcl-2蛋白的表达。结果Real．TimePCR及Western blot结果显示经转染后EJ细胞的NSBPl显著地受到抑制（P〈0．01）。CCK8结果提示EJ细胞转染后随着时间的延长,抑制率越大（P〈0．01）。流式细胞仪检测发现,经转染干预后EJ细胞G2期比例增加（P〈0．01）,而凋亡细胞并没有显著变化（P〉0．05）。Western blot结果再次验证周期蛋白CyclinBl显著下调（P〈0．05）,而CyclinD1没有统计学意义（P〉0．05）,凋亡蛋白Bcl-2也没有统计学意义（P〉0．05）。结论NSBPl是通过调控周期蛋白CyclinB1进而阻断或延缓细胞周期,而非通过细胞凋亡抑制膀胱癌细胞增殖。NSBPl在膀胱癌细胞增殖中起着重要作用。