影响PCR-RFLP的相关因素

限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.     

变性高效液相色谱分析法在人类基因组单核苷酸多态性检测中的应用

目的:检测白种人和汉族人RDH8基因序列中单核苷酸多态性(SNP)位点,探讨变性高效液相色谱分析法(DHPLC)在基因组研究中的效能.方法:建立8个由白种人和汉族人基因组DNA组成的混合样品池,并进行PCR扩增.其产物以DHPLC检测,发现杂合子信号后,对单独DNA样本进行DHPLC检测及直接测序确定其突变类型.以DHPLC结合DNA样本混合技术在150个汉族人和20个欧洲白种人样本中测定SNP的基因频率.结果:在RDH8基因中共检测到17个SNP,其中12个为新发现的,5个为已报道的;11个SNP在筛查阶段发现,6个在基因频率检测阶段发现;2个仅在白种人样本中检测到,3个SNP的MAF在两种人种间有较明显的差异;汉族人基因频率检测确定了7个常见SNP.结论:DHPLC能有效地用于基因组SNP的检测,结合DNA混合技术,更能提高其检测效力,有效地应用于基因频率的测定.     

中国人群中肾上腺素α2A受体基因SNP的分布及其对基因表达的影响

目的：在中国人群肾上腺素α2A受体(α2A-AR)基因中搜寻单核苷酸多态性(SNP)并研究其对基因表达的影响。方法：对α2A-AR基因进行序列分析，搜寻SNP。从全血中提取基因组DNA，扩增包含G／C多态性位点的239bpDNA片段。利用PCR-RFLP方法对中国北方人群α2A-AR基因-1296bp位点SNP进行基因分型。利用凝胶阻滞方法研究含G／C的390bp DNA片段与细胞核提取物的结合。结果：在中国北方人群α2A-AR基因中共发现2处SNP。-1296位SNP等位基因G、C频率分别为0．61和0．39，基因型GC,，C,C，CC频率分别为0．34，0．54，0．13。EMSA结果表明，细胞核提取物与-1296bp为C的DNA片段可特异性结合。结论：中国北方人群啦α2A-AR基因中存在2处SNP，调控区(-1296位)SNP等位基因为C的DNA片段可与特异性蛋白质结合，可能通过这一机制影响基因表达。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

熔解曲线分析法检测乙醛脱氢酶2基因多态性

目的应用熔解曲线分析法建立乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因Glu504Lys多态性分型方法并探讨其临床应用价值。方法提取受检者EDTA-K2抗凝外周血的基因组DNA,用等位基因特异性PCR(AS-PCR)扩增ALDH2基因,通过熔解曲线分析扩增峰,对乙醛脱氢酶2基因504位点的多态性进行基因分型,并与DNA微阵列芯片法的检测结果进行比较,出现结果不一致时,用基因测序法进行验证。结果对60例外周血标本进行ALDH2基因的多态性分型检测,两种方法检测结果均为野生型(Glu504Glu)27例,突变型(Lys504Lys)13例,杂合型(Glu504Lys)20例,熔解曲线分析方法与DNA微阵列芯片法分析结果完全一致(Kappa值为1)。结论本研究成功建立了基于熔解曲线分析检测乙醛脱氢酶2基因Glu504Lys多态性分型方法。     

焦磷酸测序技术对阿司匹林个体化用药相关SNP位点分型

阿司匹林的抗血小板作用在临床存在显著的个体差异,而rs5918、rs12041331和rs730012 3个单核苷酸多态性位点与阿司匹林的药效和不良反应有着密切的联系。本文基于PCR结合焦磷酸测序技术,建立了阿司匹林相关SNP位点的基因分型方法。自主设计扩增引物和测序引物;优化PCR扩增条件,使3个位点能够在相同的条件下扩增并通过梯度稀释基因组DNA检测方法的灵敏度;最后,分别基于本文建立的新方法和Sanger测序技术对20例临床样本进行3个位点的基因分型,验证该方法的准确性。结果显示,本文成功建立了阿司匹林个体化用药相关SNP位点的基因分型方法,检测下限低至0.4 ng 基因组DNA,用两种方法对20例临床样本进行3个位点的基因分型,结果完全一致,说明该方法有较高的准确性。     

脂联素基因多态性与原发性高血压的关系

目的探讨脂联素单核苷酸多态性SNP45T→G和SNP276G→T与原发性高血压之间的关系。方法原发性高血压病患者80例,正常对照160例,以聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)技术,对脂联素基因SNP45、SNP276多态性位点进行基因分型。结果SNP45和SNP276两个多态性位点的基因型和等位基因频率在原发性高血压和正常对照组中的分布无显著差异(>0.05)。结论脂联素基因SNP45和276多态性可能不是武汉地区汉族人群中原发性高血压发病的遗传学标志。     

盐析法快速提取口腔拭子DNA

目的建立盐析法快速从口腔拭子中提取基因组DNA的方法。方法首先以细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5 mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984位点进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果单支口腔拭子提取得到的DNA量在0.68～2.56μg之间,D260/D280比值在1.77～1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。结论本实验所建立的盐析法可以快速、简便、经济地从口腔拭子得到高质量的基因组DNA。     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。     

改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较

目的: 建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法。方法: 选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA。同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA。采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果。结果： 以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因。 结论： 改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求。