低频脉冲电磁场影响超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记BMSCs的增殖和成软骨分化

目的　探讨外加低频脉冲电磁场（low frequency pulsed electromagnetic fields,LFPEMFs）对超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticle,SPIO）标记的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖和成软骨分化的影响。 方法　体外培养BMSCs并进行SPIO标记。将SPIO标记的细胞分为4组并给予不同干预: LFPEMFs组,成软骨诱导组,LFPEMFs+成软骨诱导组,对照组。采用CCK8检测各组细胞的增殖情况,PCR及免疫荧光染色检测BMSCs成软骨分化水平。 结果 CCK8检测表明,LFPEMFs刺激促进细胞增殖;分化培养21 d时,LFPEMFs+成软骨诱导组细胞的Aggrecan 和CollagenⅡ表达量明显高于对照组（P<0.05）。 结论 LFPEMFs刺激可以促进SPIO标记的BMSCs的增殖和成软骨分化。     

脉冲电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞分化的研究

观察脉冲电磁场(PEMFs)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)在体外向心肌样细胞分化的影响。选用第3代rBMSCs用于实验。实验分为PEMFs诱导组、5-氮胞苷(5-Aza)诱导组和对照组:PEMFs诱导组给予rBM-SCs 50 Hz1、mT低频脉冲电磁场刺激,30 min/d,分别刺激10 d、15 d和20 d;5-Aza诱导组给予rBMSCs 10μmol/L 5-Aza诱导1d,对照组不予处理;后两组与PEMFs诱导组同步培养10、15和20 d。通过倒置相差显微镜逐日连续观察细胞的生长状况和形态特征,采用实时荧光定量PCR检测肌钙蛋白T(TNNT2)mRNA和α-辅肌动蛋白(ACTN2)mRNA表达量的变化。结果显示:对照组rBMSCs呈纺锤形、多角形或梭形,随时间延长,细胞形态无明显变化;5-Aza或PEMFs诱导后,细胞形状逐渐变长,大量细胞聚集生长,且随着诱导时间的延长,聚集趋势不断增加,刺激20 d,细胞聚集呈长链状,高倍镜下可见细胞伸长明显,且部分细胞与邻近细胞融合。与对照组相比,5-Aza诱导组TNNT2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的19.40倍(P<0.01)...     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相互作用的报道。目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用。方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×105cells/cm2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达。结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示胰岛素样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义。提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用。     

冻存人脐带间充质干细胞的成软骨分化

目的:研究从冻存人脐带组织中分离培养的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的成软骨分化能力。方法:从冻存人脐带组织中分离培养的hUC-MSCs分为诱导组与对照组,分别采用成软骨诱导分化完全培养基和常规培养基培养7 d。采用实时荧光定量(qRT)-PCR法检测干细胞中成软骨标志物ColⅡa1、ColⅩa1和蛋白聚糖mRNA的表达,免疫印迹及免疫荧光染色检测干细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达,阿尔新蓝染色检测干细胞中氨基聚糖含量。结果:hUC-MSCs成软骨诱导分化7 d后,与对照组比较,干细胞中ColⅡa1、ColⅩa1和蛋白聚糖mRNA的表达均上升,Ⅱ型胶原蛋白的表达上升,氨基聚糖含量升高(均 P<0.05)。 结论:从冻存人脐带组织中分离培养的hUC-MSCs采用成软骨诱导分化完全培养基培养7 d后可分化为成软骨细胞,可用于软骨疾病的实验研究和临床治疗。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中miR130α的表达

目的诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,初步探索miR130a在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的调控作用。方法体外TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,免疫荧光法和免疫组化染色鉴定Ⅱ型胶原,阿辛兰染色鉴定氨基葡聚糖。用Real-time PCR法检测细胞miR130a的表达。结果骨髓间充质干细胞在TGF-β1诱导下可分化为软骨细胞。培养7 d后,诱导培养组细胞miR130a表达的水平显著低于培养前的水平(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞体外诱导可以分化为软骨细胞,在向软骨细胞分化的早期,miR130a表达降低伴随着软骨细胞的分化,提示与软骨形成的过程有关。     

胰岛素样生长因子Ⅰ转染对脂肪干细胞TWEAK/Fn14信号通路的影响

背景：胰岛素样生长因子Ⅰ具有诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,通过基因转染的方式将胰岛素生长因子Ⅰ转染入脂肪干细胞或许能够更好的促进脂肪干细胞向软骨细胞分化。 目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因对脂肪间充质干细胞体外定向成软骨分化能力以及对TWEAK/Fn14信号通路的影响。 方法：构建慢病毒载体pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl基因并转染第3代人脂肪间充质干细胞,诱导细胞向软骨分化。同时将pLVX-IRES-ZsGreenl转染的脂肪间充质干细胞设为绿色荧光蛋白/脂肪间充质干细胞组,单纯脂肪间充质干细胞设为对照组。 结果与结论：与绿色荧光蛋白/脂肪间充质干细胞组和对照组相比,胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组细胞中TWEAK mRNA表达水平降低,而胰岛素样生长因子Ⅰ,Col2al和Sox9 mRNA的表达水平增加,Col2a1表达水平增加,基质金属蛋白酶3以及TWEAK的表达降低。提示pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl慢病毒转染脂肪间充质干细胞后可获得胰岛素样生长因子Ⅰ的高效表达,且能下调细胞TWEAK基因及蛋白表达,可促进体外培养的脂肪间充质干细胞转化为软骨细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

不同生长因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型转化的机制

背景：关节软骨损伤后,自身修复能力十分有限,以往医学手段无法对其进行再生修复,利用干细胞治疗软骨损伤彻底扭转了这一局面。 目的：探讨不同生长因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型的转化机制。 方法：取第5代大鼠骨髓间充质干细胞,利用不同的生长因子及生长因子组合对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导,分别为TGF-β1组、TGF-β1+IGF-1组、BMP-2+IGF-1组、TGF-β1+BMP-2组、TGF-β1+IGF-1+BMP-2组、空白对照组。诱导后21 d进行阿尔新蓝染色和茜素红染色,RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达。 结果与结论：阿新蓝染色观察可见细胞胞浆与间质存在异染情况,蛋白多糖呈绿色表达,经茜素红染色未见橘红色钙结节。初步推断,骨髓间充质干细胞已分化形成软骨细胞,不表达骨细胞表型。空白对照组Ⅱ型胶原mRNA表达呈阴性。与TGF-β1组比较,BMP-2+IGF-1组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏低,TGF-β1+BMP-2组和TGF-β1+IGF-1+BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏高(P < 0.05);且TGF-β1+IGF-1+BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于其他各组(P < 0.05)。结果表明,转化生长因子β1具备单独诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,采用胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1在诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化时具有协同作用,可以发挥出最大的诱导软骨分化效应。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

不同方式诱导骨髓间充质干细胞的效果比较

背景：以往大多采用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,但诱导效果不佳。目的：对比分析骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞共培养诱导、转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨样细胞的效果。方法：获取SD大鼠关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞,分别设置1∶2,1∶1,2∶1浓度组,以转化生长因子β1 诱导组为对照。经诱导培养20 d后MTT法检测细胞活力,阿利新蓝比色法检测氨基聚糖含量,Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达。结果与结论：转化生长因子β1组的吸光度值显著小于软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组和软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组(P < 0.05)。转化生长因子β1组的氨基聚糖含量和Ⅱ型胶原蛋白表达显著低于软骨细胞和骨髓间充质干细胞(1∶2,1∶1,2∶1)组。软骨细胞和骨髓间充质干细胞1∶1组与软骨细胞和骨髓间充质干细胞2∶1组之间各指标比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明关节软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养,可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,且骨髓间充质干细胞对软骨细胞诱导存在饱和现象。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

高频脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

背景：采用低频脉冲电磁场干预骨髓间充质干细胞增殖分化的研究很多,但采用高频(> 300 MHz)脉冲电磁场干预的研究国内未见报道。 目的：观察> 300 MHz高频脉冲电磁场照射能否促进骨髓间充质干细胞增殖,并向成骨分化。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞随机分为4组：成骨诱导组、成骨诱导＋电磁照射组、电磁场照射组、空白对照组。观察各组骨髓间充质干细胞培养过程中细胞形态、数量、总蛋白量等方面变化。 结果与结论：与未经高频脉冲电磁场照射组相比,经高频脉冲电磁场照射后,骨髓间充质干细胞胞体稍有增多,但分化方面区别微弱。电磁场照射组细胞增殖速度、总蛋白含量均低于较空白对照组(P  < 0.05)。但电磁照射组细胞凋亡率较空白对照组增加(P < 0.05)。说明高频脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞的成骨分化趋势不明显,可抑制其增殖,促进其凋亡。     

TGF-β3诱导骨髓间充质干细胞膜片成软骨分化

目的:探索转化生长因子β3(TGF-β3)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞膜片成软骨分化的潜能。方法:体外分离培养兔骨髓间充质BMSCs细胞,用含抗坏血酸培养基构建干细胞膜片,添加TGF-β3对干细胞膜片成软骨诱导分化。光镜、HE染色和Masson染色观察细胞形态、大体结构及组织学改变,阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)免疫组化染色和RT-qPCR检测成软骨标志物Col Ⅱ和蛋白聚糖(PG)的mRNA表达及蛋白合成情况。结果:TGF-β3诱导成软骨分化14 d,镜下间充质干细胞生长良好,可用镊子钳夹起膜片状结构,可卷缩成团再展开成膜。HE染色显示细胞质及细胞外基质成分均被染成粉红色,其胞核为蓝色,细胞间呈分层状排列结构。Masson染色可见胞核染成蓝黑色,其细胞质染成粉红色,周围包绕着大量染成蓝色的胶原成分。阿利新蓝染色与Col Ⅱ免疫组化染色均为阳性,对照组阴性。实验组高表达软骨细胞特异性Col Ⅱ和PG的mRNA(P0.05)。结论:抗坏血酸诱导构建的干细胞膜片经TGF-β3诱导,能成功向软骨分化及构建软骨细胞膜片。     

大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定

背景：目前椎间盘髓核组织的细胞组成和特性仍未阐明。 目的：旨在建立大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外培养体系,并对其体外多项分化潜能进行鉴定。 方法：体外培养SD大鼠盘髓核来源间充质干细胞,取第3代细胞进行三系诱导分化,将成骨、成脂和成软骨分化作为实验组,基础细胞培养作为对照组。 结果与结论：低密度培养获得的髓核来源细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长。第3代后,细胞形态趋向均一,呈成纤维细胞样生长。成骨诱导28 d,实验组茜素红染色阳性,且RunX2、osteopontin及osteocalcin表达较对照组显著增高(P < 0.05);成脂诱导21 d,实验组油红O染色阳性,C/EBPα及PPARγ2表达较对照组显著增高(P < 0.05);成软骨分化诱导21 d,实验组番红O快绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,aggrecan和Col2a1表达较对照组显著增高(P < 0.05)。可见成年SD大鼠椎间盘髓核组织中可分离培养出体外呈克隆样生长的细胞群,且有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

甲状腺素诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化中的作用

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何获得更多的组织工程所需的种子细胞是研究中的难题。 目的：探讨不同浓度甲状腺素在人脐血间充质干细胞向兔软骨细胞分化中的作用。 方法：将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照2∶1比例共培养,并用含有不同浓度甲状腺素(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)的培养基分组刺激,共培养14 d后分别观察各组细胞形态,并提取细胞RNA和蛋白质,Real-time PCR检测聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原mRNA表达量,Western blotting技术检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖蛋白表达水平。 结果与结论：加入0.01,0.1,1,10 μmol/L的甲状腺素干预后,聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均随甲状腺素浓度增加而增强,与单纯共培养组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。实验证明高浓度甲状腺素可增强人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后向软骨细胞分化的能力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels

The chondrogenic differentiation of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (MSCs) in a collagen type I hydrogel, which is in clinical use for matrix-based autologous chondrocyte transplantation (ACT), was investigated. Collagen hydrogels with 2.5 x 10(5) MSCs/mL were fabricated and cultured for 3 weeks in a serum-free, defined, chondrogenic differentiation medium containing 10 ng/mL TGF-beta1 or 100 ng/mL BMP-2. Histochemistry revealed morphologically distinct, chondrocyte-like cells, surrounded by a sulfated proteoglycan-rich extracellular matrix in the TGF-beta1 and BMP-2 treated group, with more elongated cells seen in the BMP-2 treated group. Immunohistochemistry detected collagen type II (Col II) in the TGF-beta1 and BMP-2 treated group. Collagen type X (Col X) staining was positive in the TGF-beta1 but only very weak in the BMP-2 treated group. RT-PCR analyses revealed a specific chondrogenic differentiation with the expression of the cartilage specific marker genes Col II, Col X, and aggrecan (AGN) in the TGF-beta1 and the BMP-2 treated group, with earlier expression of these marker genes in the TGF-beta1 treated group. Interestingly, MSC-gels cultured in DMEM with 10% FBS (control) indicated few isolated chondrocyte-like cells but no expression of Col II or Col X could be detected. The results show, that MSCs cultured in a collagen type I hydrogel are able to undergo a distinct chondrogenic differentiation pathway, similar to that described for MSCs cultured in high-density pellet cultures. These findings are valuable in terms of ex vivo predifferentiation or in situ differentiation of MSCs in collagen hydrogels for articular cartilage repair.     

兔脂肪干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞（ADSCs）向髓核细胞（NPCs）分化的潜能,证实脂肪干细胞可以作为种子细胞用于组织工程髓核研究.方法 提取兔ADSCs,进行培养传代至第3代,提取培养异体兔NPCs,将第3代ADSCs与NPCs共同培养作为共同培养组,将NPCs单纯培养作为单纯培养组.倒置显微镜进行细胞观察,通过RT-PCR技术测定Ⅱ型胶原mRNA和聚集蛋白多糖mRNA,测定其在共同培养3 d、7 d、14 d、21 d的表达量,两组进行对比分析.结果 共同培养组聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达量均明显高于单纯培养组.两组聚集蛋白多糖mRNA表达量比较,t=3.436,P〈0.05;两组Ⅱ型胶原蛋白表达量比较,t=2.733,P〈0.05,差异有统计学意义.结论 ADSCs具有向NPCs 分化潜能,在适当的培养条件下与NPCs共同培养可转化为髓核样细胞,同时能够促进NPCs生长.     

Effect of nicotine on chondrogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in alginate bead culture

This study was carried out to explore environmental compound such as nicotine can cause adverse effect on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Rat BMSCs were capsulated in alginate beads incubated with a chondrogenic differentiation medium and while chondrogenic differentiation of rat BMSCs were cultured for 4 weeks treated with nicotine at concentrations of 25, 50 and 100 μM. The effect of nicotine on BMSCs viability was tested using MTT assay. After chondrogenic differentiation, alginate beads sections were stained for glycosaminoglycan (GAG) with alcian blue and safranin-O. The mRNA expression of chondrogenesis related genes, including collagen type 2 alpha 1 (Col2A1), aggrecan, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) were determined by RT-PCR. Nicotine did not affect viability of BMSCs at any indicated concentration. Continuous exposure to nicotine for 4 weeks resulted in significant decrease of the area stained with alcian blue and safranin-O in a concentration-dependent manner compared with the control (P<0.05). After 4 weeks in chondrogenic medium, nicotine dose-dependently decreased the expression of aggrecan, Col2A1 and IGF-1 genes in rat BMSCs chondrogenesis compared with the control (P<0.05). It turned out that nicotine suppresses chondrogenic differentiation potential of BMSCs, leading to a poorly differentiated cartilage.     

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

背景：前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。 目的：探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。 方法：从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况。 结果与结论：原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性,CD106 阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。     

单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞肌腱样分化的影响

目的 探讨单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞(TDSCs)分化的影响,为临床肌腱损伤后的康复治疗提供理论基础。方法 取6~8周龄C57BL/6小鼠10只,无菌条件下暴露双侧后腿至脚掌,显微镜下解剖收集小鼠髌腱和跟腱组织块,体外分离培养细胞,观察第3代细胞的形态特点。(1)取传代至第3代的细胞,采用流式细胞术检测间充质干细胞标志物(CD44、CD90、Sca-1)、内皮细胞标志物(CD34、Flk-1)、造血细胞标志物(CD45),鉴定细胞是否符合TDSCs特点。(2)取传代至第3代的TDSCs进行成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化培养,分别采用茜素红、油红和阿尔新蓝染料对培养的三系细胞进行染色,鉴定细胞是否具有多向分化潜能。(3)取传代至第3代的TDSCs接种到硅胶底培养皿上,分为双轴循环拉力组、单轴循环拉力组、对照组3组。双轴循环拉力组细胞使用Flexcell^􀆿 FX-4000TM柔性基底拉伸加载系统,单轴循环拉力组细胞使用自制拉伸力生物反应器,对照组细胞无拉力。双轴循环拉力组、单轴循环拉力组施加机械负荷组的参数均设置为0.25 Hz、6%的循环拉力,在培养期间进行机械负荷加载,每天加载8 h,共加载6 d。第6天机械负荷刺激结束后,收集3组细胞进行实时荧光定量PCR (qPCR),检测肌腱、成骨、脂肪和软骨相关转录因子的表达。结果 显微镜下观察第3代TDSCs形态一致,呈梭形纤维状。(1)流式细胞技术检测结果显示,间充质干细胞标志物CD44、CD90和Sca-1表达阳性、内皮细胞标志物CD34和Flk-1表达阴性、造血细胞标志物CD45表达阴性,符合TDSCs标记鉴定特点。(2)三系分化细胞检测结果显示,提取的细胞成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,验证了提取的细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。(3)对照组、单轴循环拉力组、双轴循环拉力组3组间比较,肌腱、成骨、软骨、脂肪相关转录因子的相对表达量差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。组间两两比较:单轴循环拉力组与对照组比较,肌腱、成骨相关转录因子以及脂肪相关转录因子PPARγ的相对表达均增高,软骨相关转录因子的相对表达均降低,差异均有统计学意义(P值均＜0.05),而脂肪相关转录因子CEB/P的相对表达差异无统计学意义(P＞0.05);双轴循环拉力组与对照组比较,肌腱相关转录因子Scx、Mohawk的相对表达降低,成骨相关转录因子Runx2的相对表达增高、碱性磷酸酶(ALP)的相对表达降低,软骨相关转录因子Sox9相对表达增高、Col2a1的相对表达降低,脂肪相关转录因子的相对表达均增高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);单轴循环拉力组与双轴循环拉力组比较,双轴循环拉力组肌腱相关转录因子Scx、Mohawk、Col1a1的相对表达均降低,成骨相关转录因子ALP的相对表达降低,软骨、脂肪相关转录因子的相对表达均增高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。结论 单轴循环拉力诱导TDSCs向肌腱细胞、成骨细胞分化,而双轴循环拉力诱导TDSCs向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。单轴循环拉力的作用下可以促进体外TDSCs向肌腱细胞分化,有利于肌腱组织的再生和损伤后的修复,为临床肌腱损伤后的康复治疗提供了理论依据。     

脂肪基质干细胞的分离培养及其作为软骨种子细胞的研究

目的研究人体脂肪基质干细胞(ADSC)分离培养的方法,探讨其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力。方法取临床吸脂所得脂肪组织,胶原酶消化分离后,接种于培养基中进行原代培养,传至一代时换软骨诱导培养液进行成软骨诱导分化,定期通过阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色及免疫组化等方法进行证实。结果ADSC在体外成软骨诱导后,可向软骨细胞分化,经诱导的细胞可分泌软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原以及硫酸蛋白多糖。结论在适当诱导条件下,ADSCs有向软骨细胞分化的潜能,为软骨组织工程种子细胞来源的研究提供了新方法。