地高辛标记杜氏利什曼原虫kDNA重组片段特异性分析及序列测定

用地高辛（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记杜氏利什曼原虫ｋＤＮＡ重组片段作为探针，与不同种株利什曼原虫ｋＤＮＡ斑点杂交，获得杜氏利什曼原虫一种特异性ｋＤＮＡ片段，双脱氧核苷酸链终止法测定该片段长３２１ｂｐ，计算机检索及同源性分析比较再次表明该片段具有较高的种特异性。该片段可作为探针用于利什曼病病原体的检测，有助于虫株鉴定，也可以作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的靶序列。     

我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR-SSCP分析

目的： 分析我国不同类型流行区内脏利什曼原虫 （Ｌ．ｄ．） 分离株ｋＤＮＡ。方法： 应用利什曼原虫属特异引物１３Ａ, １３Ｂ及据杜氏利什曼原虫四川人分离株ｋＤＮＡ 微环特异片段序列设计合成的引物Ⅰ、引物Ⅱ, ＰＣＲ扩增不同流行区利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 获特定片段, 进行ＳＳＣＰ分析。结果： 用引物Ⅰ和引物ⅡＰＣＲ扩增内脏利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 在同样试验条件下, 山丘地区和荒漠地区Ｌ．ｄ． 分离株扩增出２９７ ｂｐ 特定片段, 而平原地区Ｌ．ｄ．分离株及新疆皮肤利什曼原虫未扩增出２９７ ｂｐ 特定片段。将上述各虫株的２９７ ｂｐ 特定片段进行ＳＳＣＰ分析, 可见两个山丘地区的Ｌ．ｄ．分离株ｓｓＤＮＡ 迁移率相同, 而与荒漠地区新疆７７１分离株则相差较大。用引物１３Ａ, １３ＢＰＣＲ 扩增平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株、山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株、Ｌ．ｄ．甘肃分离株,均扩增出１２０ ｂｐ 特定片段。经ＳＳＣＰ分析,平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株的ｓｓＤＮＡ迁移率完全相同; 山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株和Ｌ．ｄ． 甘肃分离株ｓｓＤＮＡ迁移率相同, 但与平原地区者明显不同; 婴儿利什曼ｓｓＤＮＡ迁移     

杜氏利什曼原虫抗原基因在大肠杆菌内表达的初步…

以λｇｔ１１噬菌体为载体，杜氏利什曼原虫前鞭毛体基因组ＤＮＡ为靶片段构建基因文库，并以杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫制备的高价兔免疫血清为探针，对文库进行筛选，获一持续阳性表达克隆，其表达肽段经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实分子量为３９ｋＤａ，与β－半乳糖苷酶分子呈非融合状态存在。     

杜氏利什曼原虫抗原基因在大肠杆菌内表达的初步研究

以λｇｔ１１噬菌体为载体，杜氏利什曼原虫前鞭毛体基因组ＤＮＡ为靶片段构建基因文库，并以杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫制备的高价兔免疫血清为探针，对文库进行筛选，获一持续阳性表达克隆，其表达肽段经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ证实分子量为３９ｋＤａ，与β－半乳糖苷酶分子呈非融合状态存在。     

用RAPD技术分析利什曼原虫DNA多态性

为了建立ＲＡＰＤ技术分析利什曼原虫ＤＮＡ多态性的方法，并进一步揭示Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌｔｒｏｐｉｃａ之间的亲缘关系，本文应用筛选的两种随机引物（Ｍ１３，３３０１）分别扩增了Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌｔｒｏｐｉｃａ的ｎＤＮＡ和ｋＤＮＡ。结果显示，两种利什曼原虫ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ均扩增出各自特有的带型，两虫种间ｎＤＮＡ、ｋＤＮＡ的扩增片段共享度Ｆ值分别为０７２７２和０８５７１。表明ＲＡＰＤＰＣＲ可作为利什曼原虫虫种分析鉴别的工具     

杜氏利什曼原虫动基体DNA种林特异片段的克隆

作者在质粒pUC18中克隆了限制性内切酶AIuI消化的Leishmania donovani四川人分离株kDNA片段,筛选后获得能区别杜氏利什曼原虫山丘疫区分离株和平原疫区分离株的的克隆pLK1-10和对杜氏利什曼原虫四川人分离株特异的克隆pLK1-14,对杜氏利什曼原虫种特异的克隆PLK1-1、pLK1-2等。这些克隆将是鉴定杜氏利什曼原虫,区别鉴定山丘及平原疫区黑热病病原体较好的探针。     

新疆利什曼原虫同工酶谱的初步研究：Ⅰ.酶谱型的分布

用５种酶ＭＥ，ＧＰＩ，Ｇ６ＰＤＨ，ＭＤＨ，ＥＳＴ的聚丙烯酰胺凝胶电泳法对新疆不同来源分离的５株利什曼原虫进行了同工酶谱的比较研究。所分析的虫株包括１株杜氏利什曼原虫，２株婴儿利什曼原虫，２株都兰利什曼原虫以及作为参比虫株的杜氏利什曼原虫（ＭＨＯＭ／ＩＮ／８０／ＤＤ８），硕大利什曼原虫（ＭＨＯＭ／ＩＱ／００／ＬＨ３２），沙鼠利什曼原虫（ＲＨＯ／ＣＮ／６２／＃ｌ）和蜥蜴利什曼原虫各１株，共分出９个酶谱型。表明不同来源的２株婴儿利什曼原虫是两个不同的酶谱型，２株都兰利什曼原虫为两个不同的酶谱型，新疆的杜氏利什曼原虫与来源于印度的杜氏利什曼原虫标准株也为两个不同的酶谱型。     

新疆克拉玛依地区几株利什曼原虫分离物的同源性分析

目的：确定新疆克拉玛依皮肤利什曼病患者和硕大白蛉吴氏亚种体内利什曼原虫的种。方法：通过酶切电泳及ＤＮＡ杂交的方法对当地病人体内和蛉体内的利什曼原虫以及参考虫株的ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ的同源性分析，研究克拉玛依病人和蛉体内利什曼原虫的基因型。结果：经ｎＤＮＡ基因型分析，表明病人与蛉体内原虫与婴儿利什曼原虫同源性大。结论：当地皮肤利什曼病的病原体为婴儿利什曼原虫，硕大白蛉吴氏亚种为该病的媒介。     

新疆克拉玛依地区几株利什曼原虫分离物的同源…

确定新疆克拉玛依皮肤利什曼病患者和硕大白蛉吴氏亚种体内利什曼原虫的种，方法：通过酶切电泳及ＤＮＡ杂交的方法对当地病人体内和蛉体内的利什曼原虫以及参考虫株的ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ的同源性分析，研究克拉玛依病人和蛉体内利什曼原虫的基因型。结果：经ｎＤＮＡ基因型分析，表明病人与蛉体内原虫与婴儿利什曼原虫同源性大。结论：当地皮肤利什曼病的病原体为婴儿利什曼原虫，硕大白蛉吴氏亚种为该病的媒介。     

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。     

杜氏利什曼原虫蛋白鳞酸酶—2C的基因克隆化与序列分析

目的 克隆杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani,Ld)1S株蛋白磷酸酶2C（PP2C）的编码基因，为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法 体外培养杜氏利什曼原虫1S株无鞭毛体，常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫（Leishmania chagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照，设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果 以杜氏利什曼原虫的基因组为模板，利用多聚酶链反应（PCR）技术，扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明，杜氏利什曼原虫1S株PP2C基因序列长度为1317bp，开放读码框架由1221bp组成，编码产物为406个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为95％（387／406）。结论 本研究克隆了杜氏利什曼虫的PP2C基因，为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼虫的基因疫苗研究奠定了基础。     

热休克蛋白70（hsp70）基因对利什曼原虫中国分离株的系统发育分析

目的选用hsp70基因探讨我国各疫区不同宿主利什曼原虫的种系发育关系。方法采用PCR方法扩增分离自中国各疫区不同宿主的利什曼原虫之热休克蛋白70（hsp70）基因,将扩增的目的片段纯化后测序。使用MEGA5．0软件对测序产物进行多序列比对并构建系统发育树,同时与国外利什曼原虫分离株的hsp70序列共同分析,观察利什曼原虫中国分离株在世界范围利什曼原虫的系统发育和分子进化中的地位。结果中国各流行疫区利什曼原虫均获得约1300bp长度的hsp70基因片段,存在丰富的多态位点。中国23株利什曼原虫经hsp70基因分型聚集为四群,其中人来源的原虫分离株均在A群,为杜氏利什曼原虫（L．donovani）,并分为杜氏利什曼原虫指名亚种（L.donovani）和杜氏利什曼原虫婴儿亚种（L．infantum）两个亚支;分离自新疆沙鼠或白蛉的6株利什曼原虫聚在B群,为都兰利什曼原虫（L．turanica）;分离自新疆白蛉和内蒙古沙鼠的两株利什曼原虫为C群沙鼠利什曼原虫（L．gerbilli）;分离自内蒙古蜥蜴和新疆白蛉的两株原虫为D群蜥蜴利什曼原虫（Sauroleishmania）。结论利什曼原虫中国分离株属于利什曼原虫亚属的不同种和蜥蜴利什曼原虫亚属,我国利什曼原虫分离株的种系发育复杂多样。     

杜氏利什曼原虫23kDa抗原编码基因克隆的表达

将已建立的杜氏利什曼原虫ｃＤＮＡ文库基因,亚克隆于ｐＵＣ１８质粒载体,诱导表达筛选两个克隆,即Ｐ１、Ｐ２,表达的蛋白分子量皆为２３ｋＤａ,Ｐ１克隆表达的２３ｋＤａ蛋白分子,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显示,可被兔抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体抗血清及内脏利什曼病病人血清识别。     

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。　结果　用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。　结论　获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。     

杜氏利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (LeishmaniadonovaniLd) 1S株激活蛋白激酶C受体 (RACK ,receptorofactivatedpro teinCkinase)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗的研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法提取制备基因组DNA。以硕大利什曼原虫 (Leishmaniaamjor)的RACK基因的核苷酸序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物。以杜氏利什曼原虫的基因组DNA为模板 ,利用多聚酶链反应(PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫RACK的全长编码基因。结果　基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株RACK基因序列长度为 981bp ,开放读码框架由 831bp组成 ,编码产物为 2 76个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的RACK基因与来源于硕大利什曼原虫的RACK基因序列同源性达 98% (2 6 4 / 2 6 7)。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的RACK基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫基因文库的构建

以改进的培养细胞ＤＮＡ抽提法有效地提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体基因组ＤＮＡ，用限制性核酸内切酶ＨａｅⅢ部分酶切，将所获的大小为１－４ｋｂ的片段与噬菌体λｇｔ１１载体臂重组，体外包装构成基因文库。结果获得２．２８×１０６个重组子，插入比例为８７％。为研究杜氏利什曼原虫基因表达和基因结构提供了基础。     

杜氏利什曼原虫前鞭毛体排泄因子抗原类型的初步研究

利用丙酮提取的排泄因子抗原与前鞭毛体免疫家兔血清以双向免疫扩散法对一株从新疆喀什地区黑热病人分离的杜氏利什曼原虫,一株自陕北病犬中分离的杜氏利什曼原虫,一株由新疆荒漠地区硕大白蛉吴氏亚种消化道中分离的杜氏利什曼原虫和一株沙鼠利什曼原虫进行抗原分析的结果表明,这四株利什曼原虫的排泄因子抗原具有两种不同的抗原成分——P和G。其中喀什绿洲地区黑热病与陕北犬株利什曼原虫均具有P成分,荒漠型黑热病杜氏利什曼原虫具有P和G两种成分。本文讨论了这一初步分型结果的生物学和流行病学意义。     

杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果　以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

河南省1例输入性内脏利什曼病的实验室诊断

目的　分析河南省1例输入性内脏利什曼病病例，探讨内脏利什曼病的实验室诊断方法。方法　分析患者的流行病学资料和临床资料，镜检观察骨髓涂片中杜氏利什曼原虫无鞭毛体；rK39试纸条检测血清中利什曼原虫抗体；用两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增利什曼原虫动基体DNA和核糖体DNA内转录间隔区基因片段。结果　 该患者曾去过内脏利什曼病流行区，有不规则发热、脾肿大、全血细胞减少、白蛋白/球蛋白比例倒置等症状，骨髓涂片查见杜氏利什曼原虫无鞭毛体，rK39试纸条检测阳性，两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增出87 bp和285 bp的片段。两片段序列与杜氏利什曼原虫相应序列的相似性分别为94%和100%。结论　结合患者的流行病学资料和临床表现以及实验室检测结果，确诊该病例为内脏利什曼病病例，病原体为杜氏利什曼原虫。     

地高辛素标记弓形虫DNA探针的制备及在产前诊断的应用

本文建立了地高辛素标记的弓形虫ＤＮＡ探针并在２３例产前咨询孕妇中作产前诊断。通过聚合酶链反应扩增弓形虫ＲＨ株ＴＧＲ４核酸片段，扩增产物７７８ｂｐ片段经寡核苷酸层析柱纯化后，用地高辛素标记作为探针，与待检材料斑点杂交。结果显示该探针与待杂交的弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ１株ＤＮＡ杂交；而与恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、杜氏利什曼原虫、大肠杆菌、巨细胞病毒ＤＮＡ无杂交。并能在待杂交液中检测出相当于１ｐｇ水平ＤＮＡ，表明该探针具有高度的特异性及敏感性。检测２３例孕期１０—１４周孕妇中，阳性３例，其中一孕妇外周血、绒毛组织及羊水均呈阳性。另一例的外周血及绒毛组织呈阳性。该探针稳定、敏感、操作简单，具有推广意义。