血管内皮生长因子及其基因对缺血脑组织保护作用与 Bax和 Bcl-2表达的相关性

目的探讨血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)基因对缺血脑组织脑梗死神经细胞的保护作用与 Bax和 Bcl-2水平的关系,以及 VEGF作用的机制. 方法 用线拴法制成 Wistar大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型,将 VEGF165真核表达质粒 (pUCCAGGS/hVEGF165)经颅骨注入到缺血区.术后 7 d断头取脑,用反转录 PCR(RT-PCR)检测 VEGF mRNA的表达强度,用免疫组织化学方法检测 Bax,Bcl-2和 VEGF的表达水平. 结果与对照组相比,治疗组 VEGF mRNA的表达增强, VEGF表达增高 [( 32.50± 2.45)个 /高倍视野比 (3.33± 1.03)个 /高倍视野, t=334.821,P< 0.01], Bax表达减弱 [( 4.11± 0.41)个 /高倍视野, t=9.168,P< 0.01], Bcl2表达增强 [( 7.94± 0.49)个 /高倍视野, t=5.335,P< 0.01]. 结论 VEGF165基因可以转化到缺血脑组织中并表达 VEGF mRNA和 VEGF,后者可能通过抑制 Bax和增强 Bcl2的表达而保护神经细胞.     

血管内皮生长因子基因诱导脑梗死大鼠热休克蛋白70变化与其梗死体积的关系

目的：观察血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死前后热休克蛋白70表达的变化，进一步研究热休克蛋白70在脑梗死中的神经保护作用。方法：实验于2003-03／2004-03在郧阳医学院附属太和医院神经科学研究所完成。选择雌性Winstar大鼠40只，常规饲养观察1周后，随机分为正常对照组5只，不造模，余35只造模后分为假手术组5只，单纯梗死组10只，空载质粒对照组10只，血管内皮生长因子基因治疗组10只。采用改进的线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，空载质粒对照组和血管内皮生长因子基因治疗组用50μL微量进样器进针约3．5mm，分别注入5μL空载质粒和质粒载体与血管内皮生长因子165基因构成的重组DNA到梗死区．7d后断头取脑。用热休克蛋白70免疫组化染色的方法显示脑中的热休克蛋白70的表达情况；用苏木精-伊红染色显示梗死区，用图像分析仪测定梗死面积。结果：40只大鼠全部进入结果分析。①热休克蛋白70的着色部位在神经细胞的细胞浆和细胞膜，黄褐色细胞即为阳性细胞。②热休克蛋白70的表达：正常对照组与假手术组基本相似[(3．00&;#177;0．89)个／高倍视野，(6．31&;#177;0．63)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组与空载质粒对照组基本相似[(23．98&;#177;3．25)个／高倍视野，(23．31&;#177;2．77)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组比正常对照组和假手术组明显增加(P&;lt;0．01)。血管内皮生长因子基因治疗组均明显高于与各组[(57．60&;#177;3．46)个／高倍视野(P均&;lt;0．01)]。⑧血管内皮生长因子基因治疗组梗死体积百分率[(9．52&;#177;1．99)％]显著低于单纯梗死组(22．31&;#177;4．18)％和空载质粒对照组[(24．48&;#177;3．51)％，P&;lt;0．01]。空载质粒组与单纯梗死组梗死体积百分率比较基本一致(P&;gt;0.05)。结论：血管内皮生长因子基因可诱导热休克蛋白70的表达增高，脑梗死体积百分率降低。说明热休克蛋白70表达增多与脑梗死体积缩小之间有一种正向关系，亦证明其可能是与缺血有关的一种保护性蛋白。     

血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体的构建与鉴定

目的　构建人VEGF16 5腺病毒表达载体 ,探讨应用血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗脑梗死的可行性。方法　采用分子克隆技术 ,以质粒hVEGF16 5·SR为模板 ,扩增hVEGF16 5成熟cDNA。经穿梭质粒PShuttle克隆到腺病毒质粒上 ,构成Adeno VEGF16 5腺病毒重组质粒 ,经酶切及测序鉴定正确后 ,包装成为重组Adeno VEGF16 5腺病毒 ,并进行电镜观察及滴度测定。用免疫印迹及免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达。结果　经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功 ,电镜显示包装细胞中有病毒存在 ,包装的病毒滴度为 8× 10 1 0 pfu ml,免疫印迹及免疫组化检测有VEGF16 5蛋白的表达 ,而对照未见VEGF16 5转录和表达。结论　构建的VEGF16 5腺病毒表达载体可在体外表达 ,VEGF基因有可能用于治疗脑梗塞     

血管内皮生长因子基因诱导脑梗死大鼠热休克蛋白70变化与其梗死体积的关系

目的:观察血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死前后热休克蛋白70表达的变化,进一步研究热休克蛋白70在脑梗死中的神经保护作用。方法:实验于2003-03/2004-03在郧阳医学院附属太和医院神经科学研究所完成。选择雌性Wistar大鼠40只,常规饲养观察1周后,随机分为正常对照组5只,不造模,余35只造模后分为假手术组5只,单纯梗死组10只,空载质粒对照组10只,血管内皮生长因子基因治疗组10只。采用改进的线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型,空载质粒对照组和血管内皮生长因子基因治疗组用50μL微量进样器进针约3.5mm,分别注入5μL空载质粒和质粒载体与血管内皮生长因子165基因构成的重组DNA到梗死区,7d后断头取脑。用热休克蛋白70免疫组化染色的方法显示脑中的热休克蛋白70的表达情况;用苏木精-伊红染色显示梗死区,用图像分析仪测定梗死面积。结果:40只大鼠全部进入结果分析。①热休克蛋白70的着色部位在神经细胞的细胞浆和细胞膜,黄褐色细胞即为阳性细胞。②热休克蛋白70的表达:正常对照组与假手术组基本相似犤(3.00±0.89)个/高倍视野,(6.31±0.63)个/高倍视野,(P>0.05)犦,单纯梗死组与空载质粒对照组基本相似犤(23.98±3.25)个/高倍视野,(23.31±2.77)个/高倍视野,(P>0.05)犦,单纯梗死组比正常对     

血管内皮生长因子及其基因对缺血脑组织保护作用与Bax和Bcl-2表达的相关性

目的：探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor．VEGF)基因对缺血脑组织脑梗死神经细胞的保护作用与Bax和Bcl-2水平的关系，以及VEGF作用的机制。方法：用线拴法制成Wistar大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型，将VEGF-真核表达质粒(pUCCAGGS／hVEGF165)经颅骨注入到缺血区。术后7d断头取脑，用反转录PCR(RT-PCR)检测VEGF mRNA的表达强度，用免疫组织化学方法检测Bax，Bcl-2和VEGF的表达水平。结果：与对照组相比，治疗组VEGF mRNA的表达增强，VEGF表达增高[(32．50&;#177;2．45)个／高倍视野比(3．33&;#177;1．03)个／高倍视野，t=334．821．P&;lt;0．01]，Bax表达减弱【(4．11&;#177;0，41)个／高倍视野，t=9，168，P&;lt;0．01】，Bcl-2表达增强【(7．94&;#177;0．49)个／高倍视野，r=5．335，P&;lt;0．01】。结论：VEGFm基因可以转化到缺血脑组织中并表达VEGF mRNA和VEGF，后者可能通过抑制Bax和增强Bcl-2的表达而保护神经细胞。     

超声联合一氧化氮微泡介导间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的 探讨超声联合一氧化氮(NO)微泡介导间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死大鼠心功能的影响,并探讨其可能作用机制.方法 选用冠状动脉左前降支结扎法制作心肌梗死模型大鼠28只,采用随机数字表法将其分为对照组(经尾静脉注入磷酸盐缓冲液)、MSCs组(经尾静脉注入MSCs)、普通微泡组(经尾静脉注入普通微泡,同时给予超声干预,然后经尾静脉注入MSCs)及NO微泡组(经尾静脉注入NO微泡,同时给予超声干预,然后经尾静脉注入MSCs),每组7只.各组大鼠分别经治疗4周后行M型心功能彩超检查,计数比较各组大鼠缺血心肌局部平均毛细血管密度,采用蛋白免疫印迹法及实时PCR检测各组大鼠心肌局部血管内皮生长因子(VEGF)表达.结果 治疗4周后发现NO微泡组射血分数[(56.27±3.66)％]较普通微泡组[(51.31±3.22)％]、MSCs组[(45.81±3.37)％]及对照组[(43.66±4.79)％]均显著提高(P＜0.05);NO微泡组心肌缺血区域平均毛细血管密度[(45.96±9.01)个/每高倍镜视野]较普通微泡组[(28.07±4.93)个/每高倍镜视野]、MSCs组[(21.41 ±5.27)个/每高倍镜视野]及对照组[(18.04±4.82)个/每高倍镜视野]均显著增加(P＜0.05).NO微泡组VEGF相对表达量(0.67 ±0.024)较普通微泡组(0.54 ±0.011)、MSCs组(0.44±0.020)及对照组(0.12±0.009)均显著增强(P＜0.05).结论 超声联合NO微泡介导MSCs移植治疗心肌梗死大鼠,能进一步提高模型大鼠心功能,其治疗机制可能与促进局部VEGF表达、加速梗死区域血管生成有关.     

经颈内动脉注射质粒介导的bcl-2 cDNA对局灶脑梗死大鼠神经细胞凋亡的影响

目的:通过观察经颈内动脉途径注射质粒介导的bcl-2cDNA对脑梗死体积、凋亡相关蛋白及神经细胞凋亡的影响,分析bcl-2基因在大鼠局灶性脑梗死中对神经细胞的保护作用。方法:实验于2004-09/2005-05在中国医科大学神经解剖实验室及病原生物学实验室完成。①将99只成年雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为3组:生理盐水组、空质粒组和bcl-2组,各33只。②各组大鼠均成功制备左侧大脑中动脉梗死模型,梗死2h后实施再灌注。再灌注3h后,经颈内动脉分别缓慢注射生理盐水、空载质粒pLXSN及质粒pLXSN-bcl-2各120μL。③脑梗死体积测定:于再灌注后24,48,72h将大鼠过量麻醉处死、取脑,脑片经红四氮唑染色,多聚甲醛固定;采用显微图像分析系统计算脑梗死体积。每组每个时间点6只。④免疫组化及TUNEL测定:各亚组其余大鼠于再灌注后24,48,72h麻醉后,经左心室进行心脏灌流、取脑,常规固定、包埋、连续冠状切片(厚6μm);免疫组化染色试剂盒染色,室温显色,常规封片。每组每个时间点5只。结果判定:每个标本取两张切片,分别在高倍镜(400×)下随机观察纹状体区不重叠的8个视野,显微图像分析系统采集分析图像。结果:进入结果分析大鼠保持99只。①大鼠脑梗死体积测定结果:bcl-2组再灌注后24,48,72h脑梗死体积较生理盐水组、空质粒组均减小(P<0.05)。②各组大鼠脑组织Bcl-2/Bax蛋白表达比较:bcl-2组再灌注后的24,48,72hBcl-2蛋白表达较两对照组相应时间点均明显增加(P<0.05),bcl-2组再灌注后24,48,72hBax蛋白较两对照组相应时间点均明显减少(P<0.05)。③神经细胞凋亡情况:bcl-2组在再灌注后的24,48,72h的脑细胞凋亡数与生理盐水和组空质粒组比较,均明显减低(P<0.01)。④生理盐水组与空质粒组各时间点的脑梗死体积、Bcl-2/Bax蛋白表达及神经细胞凋亡差异均无显著性意义(P>0.05),排除实验误差。结论:在脑梗死后数小时内,经颈内动脉注射质粒pLXSN介导的bcl-2cDNA,可以使目的基因在缺血部位表达,从而减少缺血半暗带处的神经细胞凋亡,缩小脑梗死体积;从而起到保护神经元、减轻脑损伤的作用。     

膀胱移行细胞癌组织中血管内皮生长因子表达与微血管生成的关系及意义

目的 :探讨膀胱移行细胞癌 (Transitionalcellcarcinomaofthebladder ,BTCC)组织中血管内皮生长因子 (Vas cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达与微血管生成的关系及临床意义。方法 :应用免疫组织化学二步法检测 10例正常膀胱粘膜、5 0例BTCC组织中VEGF的表达和微血管密度 (Microvasculardensigy ,MVD) ,并与临床病理资料进行分析。结果 :① 5 0例BTCC组织VEGF阳性表达率为 72 % ,MVD为 4 .4～ 13.4个 /高倍视野 ,平均值8.94± 2 .0 8,10例正常膀胱粘膜VEGF的表达均为阴性 ;MVD0 .6～ 1.6个 /高倍视野 ,平均值 1.2 0± 0 .35 ;②浸润型肿瘤组较表浅型肿瘤组MVD高 (P <0 .0 1) ,G2 和G3 级肿瘤组较G1级肿瘤组MVD高 (P <0 .0 1) ,高MVD组较低MVD组复发率高 (P <0 .0 5 ) ;③浸润型肿瘤组较表浅型肿瘤组VEGF阳性表达率高 (P <0 .0 1) ,G2 和 (或 )G3级肿瘤组较G1级肿瘤组VEGF阳性表达率高 (P <0 .0 1) ,VEGF阳性表达组BTCC复发率高 (P <0 .0 1) ;④VEGF阳性表达组MVD高 (P <0 .0 1)。结论 :①BTCC中VGEF的表达以及MVD与正常膀胱粘膜相比具有明显的特征性 ;②VEGF的表达以及MVD与BTCC分期、细胞的分级、复发相关 ,VEGF、MVD均为较理想的预测膀胱癌复发的标志物 ;③VEGF表达与MVD相关 ,VEGF能促进BTCC     

真核表达载体血管内皮生长因子转染血管内皮细胞及对新生血管形成的影响

背景:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能与存在内皮细胞表面的特异性受体结合,刺激体内新生血管形成,但在体内半衰期极短,在移植局部难以维持足够的浓度,限制了其临床应用.目的:观察VEGF与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent,EGFP)共表达载体转染对大鼠血管内皮细胞形成新生血管的影响.设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2004-09/2005-01在中国医科大学附属第一医院器官移植实验室完成.材料:30只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只.质粒pIRES2-EGFP/VEGF165由第四军医大学提供.方法:采用层析法大量提取pIRES2-EGFPNEGF165质粒,采用阳性脂质体法进行转染,计数1×106血管内皮细胞植入雄性Wiser大鼠肾被膜下.实验组:植入转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165的内皮细胞:空白转染组:植入转染质粒pIRES2-EGFP的内皮细胞:对照组:植入正常大鼠血管内皮细胞.主要观察指标:①转染72 h后观察EGFP及VEGF表达情况.②流式细胞仪检测转染效率.③植入后14 d苏木精-伊红染色观察植入血管内皮细胞处组织形态学变化.结果:30只大鼠均进入结果分析.①荧光显微镜下实验组内皮细胞有特异性的EGFP表达.②流式细胞仪分析转染效率为13.06%.③实验组血管内皮细胞胞核和胞浆中均有VEGF表达.反转录-聚合酶链反应显示实验组大鼠血管内皮细胞中有人源化VEGF165基因在mRNA水平表达.④移植后14 d.实验组大鼠肾被膜下可见成团的新生毛细血管网形成,而对照组及空白转染组虽血管内皮细胞仍存活,但未形成明显血窦.结论:转染VEGF基因是促进内皮细胞早期(14d内)形成新生血管的有效途径.     

c-FOS在VEGF 165基因治疗大鼠脑梗死中的表达

目的：观察c-FOS蛋白在血管内皮生长因子165(VEGF 165)基因治疗大鼠脑梗死中的表达情况，为。临床脑梗死的治疗提供分子学依据。方法：将Wistar大鼠制成永久性大脑中动脉闭塞模型，7d后断头取脑，用免疫组化的方法显示脑中c-FOS的表达情况。结果：正常组和假手术组大鼠各脑区无c-FOS表达，梗死组、空载质粒组及基因组均有表达，以基因组最显著。结论：脑缺血及VEGF 165基因均可诱导c-FOS的表达。     

不同途径导入rAAV-VEGF165基因对大鼠脑缺血边缘区血管内皮细胞生长因子表达的影响

背景VEGF基因可促进脑缺血边缘区的血管生长,哪种导入途径的表达效果更理想值得探讨.目的探讨脑池内及静脉导入rAAV-VEGF165基因对大鼠脑缺血边缘区血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)表达的影响,为VEGF基因治疗脑缺血提供实验依据.设计析因设计.地点和对象实验地点深圳市人民医院动物实验中心;暨南大学医学院病理教研室.健康雄性SD大鼠48只,SPF级.干预措施用线栓加环扎法建立SD大鼠持续性大脑中动脉闭塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)模型.SD大鼠48只,随机分为脑脊液导入组、静脉导入组、梗死组和假手术组,治疗组于术后24 h内将rAAV-VEGF165基因通过小脑延髓池或静脉内导入.各组分别取6只大鼠于术后7 d和14 d断头取脑,免疫组织化学染色检测VEGF的表达.主要观察指标各组大鼠不同时间脑组织VEGF阳性细胞密度.结果最终进入统计分析的大鼠保持为4组,每组12只,无缺失值.各组脑缺血边缘区VEGF阳性细胞密度(个/高倍视野,×400)分别为7 d组脑脊液导人组74.90±2.33、静脉导人组36.27±2.61、梗死组24.27±1.69和假手术组5.65±0.47(P＜0.05);14 d组脑脊液导入组95.03±1.55、静脉导人组69.17±4.29、单纯梗死组29.95±1.05和假手术组7.30±0.76(P＜0.05).结论在rAAV为载体介导下,VEGF165基因可以通过脑池内及静脉内导人转染到大鼠缺血脑组织中并表达VEGF,促进新生血管的形成,保护神经细胞,治疗脑缺血.     

hVEGF165腺相关病毒对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的探讨直接心肌注射基因重组hVEGF165腺相关病毒（rAAV—hVEGF165）对急性心肌梗死大鼠心功能的影响。方法取81只雄性Sprague—Dawley大鼠,制备急性,0．／肌梗死大鼠模型。将心肌梗死大鼠模型随机分成4组：假手术组15只;心肌梗死组25只;生理盐水纽25只;VEGF组16只。生理盐水组和VEGF组分别接受生理盐水或rAAV—hVEGF165100μ1分3点注射于梗死交界处心肌内。于注射4周后测定心肌组织VEGF含量、超声心动图参数、梗死范围、微血管数量、心钠素（atrial natriuretic peptide,ANP）水平。结果假手术组中3只大鼠、心肌梗死组中13只大鼠、生理盐水组中15只大鼠、VEGF组中7只大鼠死亡,43只大鼠进入研究。VEGF组心肌梗死范围较心肌梗死组和生理盐水组明显减小（38．6±3．0）％VS（42．5±3．8）％、（42．5±2．6）％（P〈0．05）。VEGF组的左心室射血分数显著高于心肌梗死组和生理盐水组（61．11±8．37）％VS（44．17±5．31）％、（39．40±5．48）（P〈0．01）。VEGF纽心肌组织中VEGF含量较心肌梗死组和生理盐水组有所增加。血管计数显示,VEGF组有更多的新生血管形成（522．38±82．14）mm2vs（419．99±32．17）mm2、（420．86±16．50）mm2（P〈0．01）。结论梗死区交界处心肌内直接注射rAAV-hVEGF165能够显著改善急性心肌梗死大鼠的心功能,缩小梗死范围,促进心肌内新生血管的形成。     

血管内皮细胞生长因子165基因转染干细胞促进组织工程化脂肪的存活

背景：体外构建工程组织时常因植入区血供不良或植入物建立血管化过程延长,造成种子细胞缺乏营养,代谢紊乱,增殖、分化及分泌功能受损甚至死亡,移植物最终失效。目的：观察血管内皮细胞生长因子165基因转染脂肪组织来源干细胞移植能否促进组织工程脂肪组织的血管新生。方法：利用腺病毒介导血管内皮细胞生长因子165基因体外转染人脂肪来源干细胞,然后与脂肪组织工程移植物混合移植于裸鼠背部（实验组）,以移植脂肪来源干细胞＋脂肪组织工程移植物（细胞组）、DMEM培养基＋脂肪组织工程移植物（对照组）为对照。结果与结论：移植后3个月,实验组脂肪组织存活湿质量、脂肪组织血管密度高于细胞组与对照组（P〈0.01,P〈0.05）,且细胞组均高于对照组。说明脂肪来源干细胞可促进组织工程脂肪组织的血管新生,提高存活水平,转染血管内皮细胞生长因子165基因后具有更强的促血管新生的作用。     

Plasmid-mediated VEGF gene transfer induces cardiomyogenesis and reduces myocardial infarct size in sheep

We have recently reported that in pigs with chronic myocardial ischemia heart transfection with a plasmid encoding the 165 isoform of human vascular endothelial growth factor (pVEGF165) induces an increase in the mitotic index of adult cardiomyocytes and cardiomyocyte hyperplasia. On these bases we hypothesized that VEGF gene transfer could also modify the evolution of experimental myocardial infarct. In adult sheep pVEGF165 (3.8 mg, n=7) or empty plasmid (n=7) was injected intramyocardially 1 h after coronary artery ligation. After 15 days infarct area was 11.3+/-1.3% of the left ventricle in the VEGF group and 18.2+/-2.1% in the empty plasmid group (P<0.02). The mechanisms involved in infarct size reduction (assessed in additional sheep at 7 and 10 days after infarction) included an increase in early angiogenesis and arteriogenesis, a decrease in peri-infarct fibrosis, a decrease in myofibroblast proliferation, enhanced cardiomyoblast proliferation and mitosis of adult cardiomyocytes with occasional cytokinesis. Resting myocardial perfusion (99mTc-sestamibi SPECT) was higher in VEGF-treated group than in empty plasmid group 15 days after myocardial infarction. We conclude that plasmid-mediated VEGF gene transfer reduces myocardial infarct size by a combination of effects including neovascular proliferation, modification of fibrosis and cardiomyocyte regeneration.     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合VEGF基因转染治疗心肌梗死的实验研究

目的：探讨同种异体骨髓间质千细胞（BMSCs）移植联合血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响：方法：体外分离、纯化、培养大鼠BMSCs，以BrdU标记细胞；制备、抽提、纯化质粒PAdTrack／VEGF165。结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后，随机将其分为4组（n=12），进行心肌内BMSCs移植和／或VEGF165转染，组Ⅰ：BMSCs移植＋VEGF165转染；组Ⅱ：BMSCs移值；组Ⅲ：VEGF165转染；组Ⅳ：DMEM注射作为对照组。4周后行免疫组化和超声心动图检查：结果：组Ⅰ和组Ⅱ梗死及缺血心肌处可见大量BrdU标记的移植细胞，其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为组Ⅰ〉组Ⅲ〉组Ⅱ〉组Ⅳ（P均〈0．01）。细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善，EF值增加幅度（△EF）组Ⅰ〉组Ⅱ〉组Ⅲ〉组Ⅳ（P均〈0．01）：结论：同种异体骨髓间质干细胞移植联合VEGF基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能，有利于心肌梗死后的康复。     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死

背景:骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用,但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚。目的:观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响。设计:大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察;细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验。单位:华中科技大学协和医院心内科,同济医学院心血管病研究所。材料:健康雄性Wistar大鼠94只。表达载体PAdTrack/VEGF165。方法:实验于2004-06/2005-06在同济医学院心血管病研究所实验室完成。①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞,以5-溴-2’-脱氧尿苷标记细胞。②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack/VEGF165。③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后,随机将其分为4组,每组均为12只,干细胞 质粒组、干细胞组、质粒组、对照组,分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和/或VEGF165转染、DMEM注射。④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查。主要观察指标:①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查。②血管计数。③超声心动图检查。结果:48只大鼠进入结果分析。①干细胞 质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2’-脱氧尿苷标记的移植细胞,其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞 质粒组>质粒组>干细胞组>对照组(P均<0.01)。③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善,射血分数值增加幅度为干细胞 质粒组>干细胞组>质粒组>对照组(P均<0.01)。结论:同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能。     

hVEGF165对下肢股浅静脉非体外循环下行冠状动脉旁路移植静脉术血管吻合口再狭窄的影响

目的：观察应用血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因治疗狗冠状动脉-主动脉旁路移植术吻合口再狭窄的疗效。方法构建 pcDNA3/VEGF165重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞 Kl 亚株（CHO-K1）,检测其基因、蛋白表达并转导冠状动脉架桥静脉移植术吻合口局部血管平滑肌细胞,观察其对吻合口内膜厚度、面积、狭窄率、新生内膜心肌血管内皮细胞（MEC）增殖及增殖细胞核抗原（PCNA）的影响。结果质粒构建及转染成功,pcDNA3/VEGF165能显著促进MEC增殖,并减少狗冠状动脉-主动脉旁路移植术吻合口再狭窄模型再狭窄血管的内膜厚度、面积、狭窄率。结论 VEGF165重组质粒可有效改善狗冠状动脉-主动脉旁路移植术吻合口再狭窄,为临床应用提供了前期研究基础。     

高压氧修复缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的自噬机制

目的 观察高压氧舱治疗对缺血再灌注损伤大鼠脑血管内皮细胞微管相关蛋白1轻链3 (LC3)和Beclin-1表达的影响,探究高压氧修复缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的机制。方法 54只成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=12)、缺血再灌注损伤模型组(n=18)、高压氧组(n=12)和抑制剂组(n=12)。模型组、高压氧组和抑制剂组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注损伤模型。高压氧组和抑制剂组建模后予高压氧舱治疗;抑制剂组治疗前侧脑室注射3-甲基腺嘌呤。损伤后72 h,各组进行伊文思蓝染色,观察梗死区伊文思蓝含量;模型组采用免疫荧光双标法观察LC3在CD₃₁⁺血管内皮细胞的表达;采用Western blotting检测各组梗死区皮质微血管段LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平。结果 与假手术组相比,模型组梗死区伊文思蓝含量明显升高(P < 0.01);与模型组相比,高压氧组梗死区伊文思蓝含量明显降低(P < 0.01);与高压氧组相比,抑制剂组梗死区伊文思蓝含量增高(P<0.05)。模型组损伤区CD₃₁⁺血管内皮细胞可见LC3表达;模型组梗死区微血管段Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达水平均明显高于假手术组(P < 0.01);高压氧组的LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平较模型组均升高(P<0.05);抑制剂组较高压氧组和模型组均明显下降(P<0.01)。结论 缺血再灌注损伤大鼠损伤区的血管内皮细胞存在自噬现象,高压氧舱治疗能够上调梗死区血管内皮细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达,从而促进血脑屏障修复。     

胃肠间质瘤中Ki-67、血管内皮细胞生长因子表达及其与微血管密度和细胞增殖的关系

目的:探讨Ki-67和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在胃肠间质瘤 (GIST)中的表达及与临床病理因素的关系,VEGF、微血管密度(MVD)和细胞增殖的之间的相关性。方法:采用免疫组化S-P法检测44例胃肠间质瘤组织中Ki-67、VEGF表达及计数MVD值和Ki-67增殖指数(PI)。结果:VEGF、Ki-67在GIST组织中阳性表达分别为77.3%、 63.6%,VEGF、Ki-67表达在不同大小的肿块之间有统计学差异(P<0.01);MVD值和Ki-67 PI在VEGF阳性和阴性组的比较有统计学差异(P<0.01);VEGF、MVD和Ki-67 PI之间呈显著性正相关(相关系数分别为0.26、0.44和0.84,P<0.01)。结论:VEGF促进GIST组织中的新生血管形成和肿瘤细胞的增殖、肿瘤的生长、发展和转移,Ki-67PI为GIST的预后判断提供了比较客观的依据。