抗菌肽MSI-78基因在大肠埃希菌DH5α中的克隆及阳性重组体鉴定

目的 研究抗菌肽MSI-78基因的克隆及鉴定方法 ,为抗菌肽MSI-78基因的表达及抗菌活性研究奠定基础.方法 根据MSI-78氨基酸序列及大肠埃希菌(ECO)偏爱密码子,推出MSI-78编码基因,化学合成获得MSI-78基因,ECOR Ⅰ和Pst Ⅰ消化后与pUC18载体连接并转化大肠埃希菌DH5α,α-互补筛选阳性重组菌,单酶切、双酶切、PCR鉴定阳性重组体.结果 通过ECOR Ⅰ单酶切、ECOR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切抽提的阳性重组质粒,证实阳性重组质粒中含有抗菌肽MSI-78基因,特异性引物PCR扩增也证实阳性重组质粒中含有抗菌肽MSI-78基因,说明MSI-78基因成功在大肠埃希菌DH5α克隆.结论 MSI-78基因的克隆为后期的表达、纯化及生物活性研究奠定了基础.     

乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用

目的 应用酶切pBP322-HBV，回收HBV DNA，将其克隆到高拷贝载体，获得亚克隆株pUC19-HBV，再酶切、HBV DNA标记探针，核酸杂交检测临床血清标本72份，与定量PCR，定性PCR方法对比。方法 由此获得了亚克隆株pUC19-HBV，用地高辛标记的HBV DNA探针杂交、定量PCR、定性PCR方法同时检测临床血清标本72份。结果 阳性标本份数分别为40、51、49份，阳性率分别为55．6％、70．8％、68．1％。阳性符合率分别为88．9％、84．6％、80．8％。结论 3种HBV核酸检测方法的比较，以定量PCR法最为敏感，地高辛标记HBV DNA探针检测法为特异。     

克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建

目的构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体。方法设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定。结果确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400 nmol/L,反应条件为:50℃30 min,94℃4 min,94℃30s,57℃30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确。结论构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照。     

副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建

目的：构建含副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体，检测并鉴定表达载体在转化菌的表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素（TLH）的功能奠定基础。方法：根据Genbank的tlh全基因序列，设计一对附加EcorV和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物，以VP基因组DNA为模板，用高保真Taq酶扩增出tlh基因。连接pGEM-T载体构建克隆载体，测序鉴定后，再用EcorV和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体pET32 ,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒，转化DE3，IPTG诱导，用SDS－PAGE检测tlh的表达。结果：扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有99％的同源性，重组表达载体转化DE3，能表达融合蛋白。结论：本研究成功扩增出完整的tlh基因，构建了克隆载体和表达载体，获得融合表达的目的蛋白。     

白色念珠菌hsp60基因克隆

目的:克隆白色念珠菌hsp60基因。方法:通过RT-PCR技术扩增白色念珠菌hsp60基因片段,纯化后与pMD18-T载体连接,转化并通过Amp、x-Gal、IPTG进行蓝白筛选,白色克隆提取质粒,SacⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,基因测序。结果:RT-PCR扩增得到1701bp片断,重组质粒pMD18-T-hsp60双酶切后在2692bp和1701bp处可见到酶切片段,测序结果与GenBank中白色念珠菌hsp60基因比较,同原性达99%。结论:成功克隆白色念珠菌hsp60基因,为进一步研究其免疫保护机制及制备白色念珠菌疫苗奠定基础。     

人SIK2重组质粒的构建和真核细胞转染

目的 构建人SIK2基因真核表达载体.方法 利用PCR扩增目的基因SIK2,PCR产物经纯化后与pC-MV-Tag 2B线性质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂卡那抗性琼脂糖平板;菌落PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆后,抽提质粒,利用Lipofectamnie 2000TM试剂瞬转293T细胞,24 h后,Western Blot方法检测其在真核细胞内的表达.结果 成功构建pCMV Tag-2B-SIK2重组质粒,并在真核细胞内成功表达.结论 SIK2外源表达载体的构建成功,为进一步研究其功能奠定了实验基础.     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。     

沙眼衣原体60kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 克隆和表达沙眼衣原体60kDa外膜蛋白(Omp2)基因。方法 D型沙眼衣原体感染McCoy细胞后，抽提基因组DNA，经PCR扩增出omp2基因片段，与pUCm—T克隆载体连接，酶切纯化后克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达载体pQE30／omp2，PCR、酶切及测序鉴定。IPFG诱导表达，SDS—PAGE检测有无蛋白的表达。结果 (1)获得长约1650bp的PCR产物，酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了omp2基因，序列分析结果与已知omp2序列相同；(2)SDS—PACE检测表达产物，在相对分子量60kDa处有表达条带；(3)诱导表达之菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在。结论 获得了Ct omp2基因片段，并在E．coli M15中成功表达。     

转录因子Smad2高表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定大鼠转录因子Smad2的高表达载体(简称pLJM1-Smad2)。方法首先以E3大鼠肝脏cDNA为模板、PCR法获取转录因子Smad2 mRNA CDS区(即目的基因片段);然后用Age I、EcoR I双酶切pLJM1-MGFP载体和目的基因片段,用T4DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;之后再将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;最后用PCR、Age I和EcoR I双酶切以及DNA测序鉴定重组质粒。结果 PCR、Age I和EcoR I双酶切结果均提示pLJM1-Smad2重组载体中插入了目的片段Smad2;将含有目的片段的阳性重组体克隆送上海生工进行DNA测序,并将测序结果与NCBI数据库的进行比对,确定插入片段无突变、序列完全正确,证实pLJM1-Smad2重组载体中成功插入了目的基因片段Smad2。结论成功构建了转录因子Smad2的高表达载体pLJM1-Smad2。     

PAB-Gal4-DBD-HA-Twist重组质粒的制备

目的：构建人Twist基因的表达载体pAB-Gal4-DBD-HA-Twist,为研究其转录调控机制提供实验工具。方法：重组克隆质粒pcDNA-Flag-Twist用含有特异BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物进行聚合酶链反应;对含有两种酶切位点的目的Twist基因片段和pAB-Gal4-DBD-HA载体进行酶切、分离、回收纯化、连接后转入感受态DH5α中,细菌培养,菌落聚合酶链反应、测序鉴定。结果：鉴定结果显示,Twist基因正确克隆到PAB-Gal4-DBD-HA表达载体,并且转入了大肠杆菌中。结论：成功构建了人twist基因PAB-Gal4-DBD-HA-Twist表达载体,为进一步研究其表达、调控、作用机制奠定基础。     

净化室内空气减少疾病传播

据中国疾病预防控制中心流行病学首席专家曾光教授介绍,病毒靠吸附在大气中可吸入颗粒物(0.1-0.5μm)上,靠吸收其水分和维生物才能存活。由于室内空气中微粒浓度集中(一般室内空气中每立升气体有≥0.3μm的可吸入微粒30万左右),增加了病毒在空气中的密度,更容易传染像SARS一样的疾病。 污染微粒物如果大于10μm,就会被人体的上呼吸道系统(鼻子及喉咙)所清除,但是较小的微粒物会进驻在我们的肺部,容易被人体吸收,造成人体免疫系统的严重负担。这些微粒物,我们称之为R.S.P.(人体可吸入的浮游污染微粒物)。包括有碎片、霉菌、细菌、花粉…     

鹿肠道溶瘤病毒的提纯

本文通过对鹿肠道病毒(ECCO-18)的提纯,摸索出了动物肠道溶瘤病毒的最佳提纯方案。通过差速离心法和蔗糖密度梯度超速离心后所得的提纯病毒样品,用紫外分光光度法检测可见典型的病毒核蛋白吸收曲线,用SDS-PAGE分析和电镜观察也证明该样品为病毒纯品。