CagA对AGS细胞Ca2+相关蛋白磷酸化的影响

目的:分析幽门螺杆菌(H pllori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)对人胃腺癌黏膜上皮细胞(AGS)Ca2 相关蛋白磷酸化的影响,进一步揭来H pylori的致病机制.方法:采用金属离子亲和吸附富集技术富集H pylori、H pylori CagA缺失株(H pylori △CagA)与AGs细胞相互作用4 h,以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白.利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster 2D分析软件识别差异蛋白,MALDI-TOF/OF质谱鉴定确认蛋白.结果:Hpylozi △ CagA作用的AGS细胞.与培养相同时间的AGS细胞比较表达量不变,而Hpylori △CagA作用的AGS细胞表达量发生了明显变化,表明此蛋白的变化是单纯由CagA引起的;此类蛋白点共鉴定出19个,其中3个蛋白点与Ca2 相关.钙离子结合蛋白(nucleobindin-2 precursor,CALNUC)在AGS细胞以及H pylori △CagA与AGS相互作用的2-D胶中表达量接近,而H pylori与AGS相互作用后该蛋白表达量明显降低.结论:H pylori △CagA进AAGS细胞可能会影响内质网、线粒体及高尔基体的钙稳态,诱发内质网、线粒体、高尔基体凋亡或增殖途径.而成为胃炎、胃溃疡、胃癌发生的诱因之一.     

幽门螺杆菌CagA对胃上皮细胞线粒体功能的影响

目的评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)细胞毒素相关蛋白CagA对胃上皮细胞线粒体功能的影响。方法用CagA基因失活突变Hp菌株(1004Hp△cagA)和野生型1004Hp菌株分别感染人胃上皮细胞GES-1和AGS 24 h,收集标本。Western blot检测各组细胞中CagA蛋白、线粒体融合分裂蛋白Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1的表达情况;加入JC-1荧光探针后,荧光显微镜观察各组细胞线粒体膜电位变化;ATP检测试剂盒检测各组细胞中ATP生成水平的变化。结果 Western blot鉴定显示野生型1004Hp中有CagA的表达,而1004Hp△cagA无CagA的表达。1004Hp感染组与1004Hp△cagA感染组比较,线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2表达下降(P0.05),线粒体分裂蛋白Fis1、Drp1表达上升(P0.05),线粒体膜电位下降,且在GES-1和AGS两株细胞结果一致。1004Hp感染组和1004Hp△cagA中AGS和GES-1细胞ATP相对生成量分别为0.30±0.03、0.64±0.04和0.64±0.01、1.23±0.19,AGS中1004 Hp感染组较1004 Hp△cagA感染组ATP生成水平下降53.1%,GES-1中1004 Hp感染组较1004 Hp△cagA感染组ATP生成水平下降48.0%(P0.05)。结论 Hp/cagA影响线粒体动态平衡,诱发功能障碍,可能是Hp引起胃部病理变化的原因之一。     

人胃上皮细胞中幽门螺杆菌CagA相关未知磷酸化蛋白和磷酸化位点分析

背景：细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）是Ⅰ型幽门螺杆菌（H.pylori）的主要毒力因子。H.pylori胃癌、胃炎相关株和CagA缺失（△CagA）株的蛋白质组学研究尚未发现CagA相关生物标记蛋白。目的：分析H.pyloriCagA阳性株和△CagA株作用后人胃上皮细胞中差异表达的未知磷酸化蛋白和磷酸化位点,为研究CagA的致病机制提供线索。方法：以金属离子亲和吸附富集技术富集经H.pylori标准株和△CagA株作用4h的人胃腺癌细胞株AGS的磷酸化蛋白,双向电泳（2-DE）分离蛋白,飞行时间质谱（TOF-MS）技术鉴定差异蛋白点。结果：H.pylori标准株作用后,AGS细胞FAM50A蛋白276位丝氨酸发生磷酸化,PQBP1蛋白227～251序列中有磷酸化位点。与H.pylori标准株相比,△CagA株作用于AGS细胞可引起至少13种未知磷酸化蛋白的变化,其质谱图中均出现中性丢失峰,其中2种表达量增加,4种表达量降低,6种消失,1种新发生磷酸化。结论：CagA阳性H.pylori感染可致AGS细胞FAM50A和PQBP1蛋白发生磷酸化。所发现的13种未知磷酸化蛋白为揭示CagA的致病机制提供了线索。     

幽门螺杆菌CagA对AGS细胞RNA转录相关磷酸化蛋白的影响

目的研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）细胞毒素相关蛋白A（CagA）作用后人胃腺癌上皮细胞（AGS）RNA转录相关蛋白磷酸化的变化情况，进一步揭示CagA的致病机制，为寻找生物标记蛋白奠定基础。方法采用金属离子亲和吸附富集技术富集H.pylori、H.pylori CagA缺失株（H.pylori△CagA）与AGS细胞相互作用4h、以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白，利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋门，ImageMaster 2D分析软件比较分析识别差异蛋白，4700型MALDI源蛋白分析器确认蛋白。结果CagA致使AGS细胞的7个RNA相关的磷酸化蛋白出现差异表达，其中1个磷酸化蛋白表达量上调、4个磷酸化蛋白表达量下调、2个新出现磷酸化的蛋白。hnRNP D0 127位的苏氨酸及137位的丝氨酸发生了磷酸化。结论CagA作用后，致使hnRNP D0蛋白磷酸化。AGS细胞与RNA转录相天蛋白磷酸化的变化，呈现出诱导细胞凋亡、增殖及有利于细胞免疫逃逸的趋势。     

Cag A阳性幽门螺杆菌对胃癌细胞lncRNA DLEU2表达及上皮间质转化的影响

目的 探讨细胞毒素相关蛋白A(Cag A)阳性幽门螺杆菌（Hp）对胃癌细胞长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因2(DLEU2)表达及上皮间质转化的影响。方法 体外培养胃癌细胞系HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28以及正常胃黏膜上皮细胞系GES1，采用RT-qPCR法检测DLEU2表达，并选择DLEU2表达最高的胃癌细胞进行后续实验。将Hp NCTC标准菌株26695或11637分别与正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞共培养0、3、9、12 h，采用RT-qPCR法检测DLEU2表达。采用Western blotting法检测与NCTC 26695或11637共培养3、9、12 h正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞Cag A表达以及共培养3、9、12 h神经钙黏着蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达。同时，分析与NCTC 26695或NCTC 11637共培养的胃癌细胞DLEU2、Cag A表达与N-cadherin、Vimentin表达的关系。结果 HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28细胞DLEU2相对表达量均高于GES1细胞（P均<0...     

幽门螺杆菌毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

目的检测幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)主要毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白parkin、p62、LC3表达的影响,为Hp致胃癌的研究提供理论基础。方法用cagA基因失活突变Hp菌株(1004Hp△cagA)和野生型Hp/cagA+菌株(1004Hp)感染原代胃癌细胞,感染6h收集细胞蛋白,用高表达cagA的真核表达载体pcDNA3.1/cagA脂质体转染胃癌细胞AGS,24h收集细胞蛋白,用Western blot检测各组细胞线粒体自噬相关蛋白parkin、p62、LC3表达变化。结果 parkin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在1004 Hp△cagA感染组分别为0.97±0.23、1.71±0.23、1.03±0.14,1004Hp感染组分别为1.61±0.32、2.26±0.08、1.32±0.04,1004Hp感染组较1004Hp△cagA感染组升高了1.66倍、1.32倍、1.27倍,差异有统计学意义(F值分别为7.96、15.35、11.09,P0.05);parkin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在pcDNA3.1空载体转染组分别为1.15±0.14、0.75±0.23、0.74±0.19,pcDNA3.1/cagA转染组分别为1.49±0.02、1.01±0.02、1.29±0.07,pcDNA3.1/cagA转染组较pcDNA3.1空载体转染组升高1.29倍、1.35倍、1.74倍,差异有统计学意义(F值分别为17.48、14.02、21.06,P0.05)。Hp/cagA+感染和pcDNA3.1/cagA转染取得一致结果,提示Hp cagA注入胃上皮细胞后影响细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。结论Hp CagA对线粒体自噬有一定的调控作用,其可能是Hp诱导胃癌发生发展的分子机制。     

幽门螺杆菌诱导胃黏膜细胞AGS产生IFN-γ的研究

目的用幽门螺杆菌诱导胃黏膜细胞AGS产生IFN-γ,探讨胃黏膜细产生IFN-γ的机制。方法用幽门螺杆菌感染胃黏膜细胞株AGS,用RT-PCR测定细胞表达IFN-γ的RNA,用ELISA法测定细胞产生的IFN-γ蛋白;用幽门螺杆菌的主要毒力CagA阳性质粒转染细胞,ELISA测定细胞产生的IFN-γ;CagA阳性质粒转染细胞后加入MeK/ErK、Src、P38和NF-kB的抑制剂,用ELISA测定细胞产生IFN-γ的变化。结果 AGS细胞感染幽门螺杆菌后可检测到IFN-γRNA和蛋白的表达,CagA阳性质粒转染细胞后引起IFN-γ蛋白的表达,MeK/ErK、P38和NF-kB引起IFN-γ表达量下降。结论幽门螺杆菌感染胃黏膜细胞AGS诱导产生IFN-γ,幽门螺杆菌的主要毒力CagA可诱导IFN-γ的产生,CagA诱导IFN-γ的产生依赖于MeK/ErK、P38和NF-kB三者参与的信号途径。     

幽门螺杆菌CagA与胃癌的研究进展

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。在胃癌的发病机制中,细胞毒素相关基因A（CagA）阳性的幽门螺杆菌（Hp）感染起着至关重要的作用。此文就胃癌发病机制中CagA与Hp的Ⅳ型分泌系统、SHP-2、PAR1b、β-链蛋白等的相互作用作一综述。     

幽门螺杆菌和非甾体抗炎药对胃上皮细胞增殖的影响

目的　从体外研究的角度探讨幽门螺杆菌 (Hp)和非甾体抗炎药 (NSAID)对胃上皮细胞增殖的影响及其相互作用。方法　胃癌细胞株AGS与Hp和 (或 )吲哚美辛、阿司匹林体外共培养 ,通过MTT比色法和WesternBlot法检测增殖细胞核抗原 (PCNA) ,观察Hp和NSAID对胃上皮细胞增殖的影响。结果　MTT比色法显示CagA阳性的标准Hp菌株NCTC116 37能明显促进胃上皮细胞增殖 ,吸光度 (A)值明显升高 (P <0 .0 5 ) ,而CagA阴性的标准Hp菌株NCTC12 90 8则未发现有促增殖作用 ,且Hp对上皮细胞生长的效应取决于Hp作用的密度 ,在低密度 (3.2× 10 4～ 4 .0× 10 6CFU/ml)时NCTC116 37促进胃上皮细胞生长 ,在高密度 (>2× 10 7CFU/ml)时则抑制其生长 (P <0 .0 5 )。吲哚美辛和阿司匹林均能抑制胃上皮细胞生长 (P <0 .0 5 ) ,并呈浓度依赖性。当Hp和NSAID共同作用于AGS细胞时 ,Hp的促生长作用被逆转 ,呈现出抑制细胞生长的效应 ,A值明显降低 (P <0 .0 5 )。PCNA的WesternBlot检测结果发现 ,Hp菌株NCTC116 37可明显促进细胞PCNA的表达 ,而吲哚美辛和阿司匹林则抑制其表达 ,当两者共同作用于AGS细胞时 ,PCNA的表达明显减弱。结论　Hp对胃上皮细胞的增殖效应与Hp的密度及菌株差异有关 ,CagA阳性的Hp易促进胃上皮细胞生长 ,NSAID可抑制其     

幽门螺杆菌CagA基因株致病机理及与胃十二指肠疾病的关系

幽门螺杆菌(Hp)的毒力决定其致病能力。感染了Hp的人群大部分无症状,只有少数人表现不同程度的症状,可能是感染了不同毒力的茵株所致。有细胞毒相关蛋白(CagA)基因的均为高毒株,与消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌密切相关。对CagA~+株深入研究有助于加深对Hp致病机理的认识。     

黄芪总黄酮对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的研究黄芪总黄酮（Total flavonoids of Ast ragalus,TFA）对体外培养的乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度的作用。方法实验应用钙离子荧光指示剂Fluo-3AM负载原代培养的乳鼠心肌细胞,通过激光共聚焦扫描显微镜上机检测,记录其荧光强度变化,同时观察黄芪总黄酮对乳鼠心肌细胞及化学处理因素H2O2损伤大鼠心肌细胞的荧光强度的作用。结果①H2O2损伤的乳鼠心肌细胞游离钙离子[Ca^2＋]i平均荧光强度值为（1346．89±65．36）nmol／L,与对照组平均荧光强度值（743．15±34．78）nmol／L相比,差异有统计学意义（P〈0．01,n=7）;同时H2O2（0．3mmol／L）使予给TFA（20mg／kg）组乳鼠心肌细胞的[Ca^2＋]i平均荧光强度值由（668．29±41．15）nmol／L下降到（649．31±39．17）nmol／L,差异无统计学意义（P〉0．05,n=7）。结论H2O2可明显升高乳鼠心肌细胞游离钙离子浓度,黄芪总黄酮可对抗H2O2的这种作用。     

Claudin在幽门螺杆菌和AGS细胞相互作用不同时间点表达分析

目的研究Claudin家族成员在Helicobacterpylori（H．pylori）和AGS相互作用的不同时间点表达谱变化。方法TRIzol方法提取H．pylori26695攻击AGS细胞0、0．5、2、4、6h时间点的细胞总RNA样品，对样品mRNA进行线性扩增后，应用IlluminaHuman-6芯片检测基因表达量，以DetectionScore≥0．99；IDiffScoreI≥13；方差分析（ANOVA）P≤0．05作为筛选差异基因的标准；比较Claudin家族成员的表达量．结果Claudin家族有4个成员存在差异表达，其中在早期Claudin15下调，4h后无差异，Claudin2、23早期上调后于4h和6h分别恢复至无差异水平，而Claudin6在0．5h后持续上调。结论Claudin蛋白家族2、6、15、23成员参与H．pylori感染过程，并且呈现时序性变化，为H．pylori感染能引发胃癌机制研究提供线索。     

地塞米松快速抑制气道平滑肌细胞收缩的机制初探

目的通过对平滑肌细胞进行地塞米松快速预处理,拟证实糖皮质激素（glucocorticoids,GC）对气道平滑肌细胞内三磷酸肌醇（trisphosphate,IP3）和细胞内游离钙离子（[Ca^2＋]i）浓度升高有快速抑制作用。方法原代培养的大鼠气道平滑肌细胞,比较不同浓度地塞米松预处理后10min与对照组之间游离钙上升情况的区别。利用离子交换层析液闪法和Fura-2／AM显微荧光检测技术,分别检测肌IP3和[Ca^2＋]i在受到激动剂刺激后的浓度变化;同时设米非司酮（mifepristone,Ru486）及放线菌酮（cycloheximide,CHX）对照组,排除基因组作用在该反应中的影响。结果用GC温浴大鼠气道平滑肌细胞10min,能够明显降低刺激物引起的气道平滑肌细胞内IP3和[Ca^2＋]i峰值。以上反应均不能被RU486和CHX影响或者逆转。结论GC能够通过非基因组作用快速抑制刺激物引起的气道平滑肌的收缩反应,使细胞内IP3和[Ca^2＋]i浓度降低。GC对于气道平滑肌的收缩可能存在着快速抑制作用,并且这一作用是通过非基因组机制实现的。     

薯蓣皂苷对培养乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

目的研究薯蓣皂苷对培养乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法采用体外培养乳鼠心肌细胞，建立缺氧／复氧损伤模型，以薯蓣皂苷进行干预。心肌细胞随机分为5组：空白对照组（C组）；缺氧／复氧组（A／R组）；薯蓣皂苷（Dioscin）低、中、高剂量干预组（Dioscin＋A／R组）。分别观察各组心肌细胞搏动频率；MTr法测细胞存活率；用Rhl23荧光探针标记线粒体，检测荧光强度以反映线粒体膜电位（△ψm）变化；Fluo-3负载心肌细胞，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子浓度变化。结果薯蓣皂苷干预组心肌细胞搏动频率、细胞存活率、△ψm与A／R组比较明显升高；细胞内平均钙离子荧光强度显著低于A／R组。结论从细胞水平初步证实薯蓣皂苷预处理心肌细胞对A／R损伤有一定保护作用，保护机制可能涉及对线粒体膜保护和防止细胞内钙超载等。     

肺小动脉平滑肌细胞内钙离子平衡调控在胚胎肺循环高阻力机制中的作用研究

目的:探讨细胞外钙内流和细胞内钙库释放这2条途径及相对应的离子通道在低氧介导胚胎肺小动脉平滑肌细胞(small pulmonary artery smooth muscle cell,SPASMC)胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)升高中的作用,以期能够了解肺循环在胚胎低氧环境下保持高阻力的机制和胚胎学基础。方法:培养孕期120 d左右胎羊的SPASMC。通过激光共聚焦显微镜动态观察模拟胚胎低氧环境下胚胎SPASMC游离Ca2+离子浓度的变化以及与细胞外钙内流和细胞内钙池释放相关的离子通道抑制剂对该[Ca2+]i变化过程的影响。结果:SPASMC从正常氧环境转换到低氧环境后2 min,[Ca2+]i开始升高,并在第9 min升至最高点。无钙液抑制细胞外钙内流时,该过程被抑制,与细胞外钙内流相关的电压门控型钙离子通道(voltage-gated calcium channel,VOCC)抑制剂尼莫地平不能完全抑制该Ca2+离子浓度升高的过程。IP3敏感性钙池抑制剂2-APB在该过程的早期抑制了Ca2+离子的升高。结论:在低氧介导胚胎SPASMC胞浆[Ca2+]i升高过程中,细胞外钙内流发挥了主要作用。但除了VOCC,可能还有其他机制在细胞外钙内流介导该过程的机制中起作用。     

幽门螺杆菌感染途径的探讨

目的检测幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者的粪便是否存在活的Hp,以探讨Hp的传播途径。方法收集60例胃粘膜快速尿素酶试验强阳性患者的胃粘膜和新鲜粪便,进行Hp的分离培养和PCR检测。结果52份胃粘膜标本分离到Hp,阳性率86.7%;6份粪便标本分离到Hp,阳性率10.0%,其中4份来自慢性胃炎患者,2份来自消化性溃疡患者。粪便培养阳性的患者胃粘膜培养均阳性;PCR检测同一患者两种标本分离菌株的细胞毒素相关蛋白基因（CagA）和空泡毒素信号序列s1a基因（VacA s1a）一致,其中4株为CagA＋和VacA s1a＋,另2株VacA s1a＋和尿素酶A亚单位（UreA）基因阳性。结论Hp感染者的粪便中有活的Hp存在,该菌可能通过粪-口途径传播。     

参麦注射液对哮喘模型大鼠气道平滑肌钙通道活性的影响

目的：探讨参麦注射液对哮喘模型大鼠气道平滑肌L型钙通道活性的影响。方法：应用膜片钳全细胞记录技术，观察哮喘大鼠气道平滑肌L型钙离子通道活性的变化及静脉应用参麦注射液对其活性的影响。结果：①哮喘气道平滑肌钙通道活性较正常对照组显著升高（P〈0．05）；②静脉应用参麦注射液可显著下调增强的钙通道活性（P〈0．05）。结论：参麦注射液可显著下调哮喘大鼠气道平滑肌钙通道活性，可能对哮喘的防治具有一定的积极意义。     

Determinants and consequences of different levels of CagA phosphorylation for clinical isolates of Helicobacter pylori

BACKGROUND & AIMS: The Helicobacter pylori cag pathogenicity island encodes a secretory system that translocates CagA into epithelial cells, where it becomes tyrosine phosphorylated and induces cytoskeletal rearrangements. Strains with more CagA tyrosine phosphorylation motifs are most closely associated with gastric cancer. Here we assess whether clinical strains can deliver CagA, whether strains with different numbers of CagA phosphorylation motifs have CagA phosphorylated to different degrees, and whether this induces different amounts of epithelial cytoskeletal change. METHODS: Forty-four H. pylori strains from South African patients, all cagA gene positive, were cocultured with the gastric adenocarcinoma cell line AGS. CagA expression and phosphorylation were determined by Western blot and interleukin-8 secretion by enzyme-linked immunosorbent assay. The cagA 3' variable regions of 22 strains were sequenced and shown to possess 3-6 phosphorylation motifs. These strains were used to quantify CagA phosphorylation and cytoskeletal rearrangements. RESULTS: cagA genotype and typing of cag pathogenicity island genes were poorly predictive of phenotype. Thirty-four of 44 strains expressed CagA protein that could be delivered to and phosphorylated within AGS cells. Only these 34 strains induced interleukin-8 secretion from AGS cells. Among those strains, the number of CagA tyrosine phosphorylation motifs determined the degree of CagA phosphorylation and the level of biologic activity in terms of degree and extent of AGS cell elongation. CONCLUSIONS: H. pylori strains that deliver CagA with more phosphorylation motifs induce higher levels of CagA phosphorylation in epithelial cells, induce more cytoskeletal changes, and are more likely to be associated with gastric cancer.