胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响.结果结果 GCRG213正向和反向克隆正确插人真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率.结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素.     

胃癌相关基因GCRG213正反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响

目的:观察胃癌相关基因GCRG213体内正、反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响.方法:将对数生长期的胃癌细胞株MKN45接种到裸鼠皮下,成瘤后用制备好的分别含GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的腺相关病毒分别在肿瘤局部注射,以空病毒和生理盐水对照,继续喂养2 wk后处死,取肿瘤测量重量,并用半定量RT-PCR检测肿瘤组织GCRG213mRNA表达水平.结果:裸鼠接种MKN45细胞3 wk左右皮下形成肿瘤结节.肿瘤组织重量在正向转染组为5.12±1.02g、反向组1.22±0.46g、RNAi组0.81±0.37g、空病毒组3.13±0.69g、生理盐水组3.45±0.87g;各组GCRG213 mRNA表达水平依次分别为0.406±0.01 3,0.211±0.021,0.087±0.015,0.312±0.050,0.283±0.061.结论:三种腺相关病毒分别有效地介导了GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的体内表达,提高或降低了GCRG213 mRNA的表达水平,促进或抑制了胃癌种植瘤的生长.     

细小病毒H-1非结构蛋白NS1基因对人胃癌细胞的抑制作用研究

前期研究表明细小病毒H-1（H-1PV）对胃癌细胞生长具有一定抑制作用,非结构蛋白NSl可能是其细胞毒作用的效应蛋白。胃癌细胞CD44^＋群体中可能含有肿瘤干细胞。目的：探讨H-1PV非结构蛋白NSl基因对不同分化程度的人胃癌细胞的影响。方法：以双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒pcDNA3．1-NSl,采用脂质体法将重组质粒转染高分化胃癌MKN28细胞、中分化胃癌SGC7901细胞和低分化胃癌MKN45细胞,并设置空质粒转染对照。G418筛选稳定转染的细胞克隆．以RT-PCR法检测NSl基因表达、裸鼠体内成瘤实验检测NSl基因对不同分化程度胃癌细胞的作用．流式细胞术分析CD44表达。结果：重组质粒pcDNA3．1-NSl转染的三种胃癌细胞均稳定表达NSl基因。以10^6／300μl浓度的肿瘤细胞皮下接种裸鼠3周后,MKN28细胞空质粒转染组和重组质粒pcDNA3．1-NSl转染组均观察到肿瘤生长;SGC7901、MKN45细胞空质粒转染组形成瘤体,而重组质粒pcDNA3．1-NSl转染组未见瘤体。转染重组质粒pcDNA3．1-NSl后,MKN28细胞不表达CD44,SGC7901和MKN45细胞CD44表达明显降低。结论：H-1PV非结构蛋白NSl基因表达对中低分化的胃癌细胞有较好的抗肿瘤活性．可能与其降低胃癌干细胞表型CD44的表达有关。     

PEBP1基因对胃癌细胞生物学特性影响的体外实验研究

目的探讨PEBP1基因对于胃癌细胞增殖状态、细胞周期、凋亡状态等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将PEBP1基因插入载体pcDNA3.1构建PC-PEBP1真核表达载体。脂质体转染胃癌细胞系MKN45建立稳定转染细胞系(MKN-PEBP1),而后使用生长曲线法、平板克隆形成实验法、流式细胞仪、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性变化。同时设立pcDNA3.1空载体转染组(MKN-PC)和空白MKN45细胞组(MKN45)为对照。结果与MKN-PC组和MKN45组相比,转染MKN-PEBP1载体的稳定表达细胞株生长显著减慢,MKN-PC组和MKN45组之间无显著差异,平板克隆形成实验结果显示,MKN-PEBP1转染组平均克隆形成率显著低于MKN-PC组和MKN45组(P<0.05),细胞周期检测显示MKN-PEBP1组处于G0/G1期的细胞比例显著高于未处理的MKN45组细胞和MKN-PC组细胞(P<0.05),而处于G2-M期的细胞比例显著均低于其他两组(P<0.05),其他各期细胞比例均无显著差异。流式细胞仪法检测细胞凋亡结果显示各组细胞的凋亡比例均为2.0%左右,统计学检验无显...     

生长抑素受体SSTR 3基因对胃癌细胞生长的影响

目的克隆生长抑素受体SSTR3基因,构建其真核表达载体,外进行转染研究,探时SSTR3基因在胃癌细胞中的作用。方法从永生化的胃上皮细胞系GES中提取总RNA,经RT－PCR扩增出SSTR3基因．并构建真核表达载体pcDNA 3．1（＋）－SSTR3,转染胃癌细胞系MKN 45,以MTT法和流式细胞仪观察转染SSTR基因前后使用奥曲肽对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。结果克隆的SSTR 3基因测序正确;构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）SSTR3能高表达SSTR3蛋白;转染SSTR3基因的胃癌细胞系MKN 45加用奥曲肽后,出现明显的增殖抑制和凋亡发生。结论SSSTR3基因介导了生长抑素类似物引起的胃癌细胞的增殖抑制和凋亡发生。通过基因转移使原来不表达SSTR3基因的胃癌细胞再表达,为生长抑素和SSTR3基因治疗胃癌提供了又有效途径。     

表达胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的:构建一个表达胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备能靶向性抑制GCRG213表达的重组腺相关病毒.方法:将构建好并经验证的包含胃癌相关基因GCRG213特异性小干扰RNA片段GCRG213-RNAi-2的IMG800-GCRG213i-2质粒用Bam H I Bg/Ⅱ双酶切,回收410 bp左右目的片段,将pSNAV2.0质粒用BamH I单酶切后同目的片段连接,经酶切和测序鉴定后,用新建质粒脂质体转染BHK-21细胞,G418筛选后大规模培养,再用辅助病毒HSV1-rc/△UL2感染,获取病毒.结果:成功构建包含U6启动子和胃癌相关基因GCRG213特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为5×10~(12)vector genome/L高滴度腺相关病毒.结论:载体的构建为进一步研究GCRG213的体内功能打下了基础,也将为更多的基因干预和基因的功能研究提供有效的工具.     

人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之一.本研究旨在获得hCOX-2编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法按文献报道的hCOX-2核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系SGC7901中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列.PCR产物经DNA序列测定证实后,利用引物5端引入的EcoRⅠ,XbaⅠ酶切位点,通过粘端连接,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中.对两种重组质粒分别进行相应的酶切鉴定.采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞,经G418筛选后,随机挑选细胞克隆.通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化.结果应用RT-PCR反应扩增获得大小约1.9kb的特异性片段.经DNA序列分析,证实与文献报道的hCOX-2编码区序列一致.重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ,XbaⅠ双酶切后,产生大小约5.4kb,1.9kb的片段;重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过Pst Ⅰ酶切,产生大小约4.5kb,1.5kb与1.3kb的片段,与预期结果相符.转染细胞经筛选后,随机挑选、扩增了3个细胞克隆,其中1个克隆稳定表达COX-2反义核酸,RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著下降.结论成功克隆了hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.反转录PCR是克隆基因的简便、有效方法.为扩增高GC含量的cDNA模板,可在PCR反应体系中加入适量的DMSO,并采用较高退火温度.在PCR引物中加入限制性内切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆.COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到稳定转染,转染细胞COX-2mRNA表达显著受抑制.     

胃泌素对胃癌细胞EMT和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响

目的探讨高表达胃泌素(gastrin)对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响及可能机制。方法用gastrin过表达质粒pcDNA3-gastrin及空载体pcDNA3.1转染胃癌细胞SGC-7901、MKN45,48 h后收集细胞蛋白,Western印迹检测鉴定gastrin表达,检测EMT相关标志物E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Snail及wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路相关基因wnt3α、β-catenin、c-myc的蛋白表达变化。结果在SGC-7901、MKN45细胞中成功过表达gastrin。与pcDNA3.1空载体转染组相比,pcDNA3.1-gastrin转染SGC-7901、MKN45细胞中上皮标志蛋白E-cadherin表达下调,间质标志蛋白N-cadherin、Snail表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);同时Wnt/β-catenin通路蛋白相关蛋白wnt3α、β-catenin及其下游基因c-myc的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达gastrin能够激活Wnt/β-catenin信号通路和促进胃癌细胞SGC-7901和MKN45发生EMT。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

WWOX 基因转染对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及其机制探讨

目的：探讨外源性WWOX基因转染对人卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及机制。方法用脂质体介导的方法将pcDNA3．1-WWOX真核表达载体转染人卵巢癌干细胞,分为pcDNA3．1-WWOX重组质粒组、空质粒组及未转染组。应用G418筛选阳性细胞克隆并扩增,Western blot法检测各组细胞WWOX蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞DNA周期变化,Western blot方法检测各组细胞Cyclin D1、CDK4蛋白的表达。结果重组质粒组WWOX蛋白高表达,空质粒组及未转染组细胞未检测到WWOX蛋白的表达。重组质粒组细胞的G0/G1期细胞比例高于空质粒组及未转染组（P＜0．01）,S期比例低于空质粒组及未转染组（P＜0．01）。重组质粒组Cyclin D1、CDK4表达均低于空质粒组及未转染组（P＜0．05）。结论 WWOX基因转染可能通过下调Cyclin D1、CDK4的表达而抑制人卵巢癌干细胞增殖,可能为卵巢癌的生物治疗开辟新的思路。     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

目的：建立稳定高表达重组人组织激肽释放酶7基因（ KLK7）的前列腺癌细胞株DU145,为前列腺癌发生机制的研究奠定基础。方法 PCR法扩增KLK7 cDNA,并克隆到真核表达载体pcDNA3．1上;经过限制性内切酶酶切、DNA测序验证正确后,以脂质体法转染人前列腺癌DU145细胞;通过G418筛选,每个单克隆细胞扩大培养,建立稳定转染KLK7的DU145单克隆细胞株。采用Western blot 法检测DU145细胞株KLK7表达。结果酶切鉴定及DNA 测序分析显示 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体成功构建;转染后,成功获得稳定高表达KLK7的DU145单克隆细胞株。 Western blot 结果显示,pcDNA3．1-KLK7转染的DU145细胞KLK7表达量明显高于转染空载体组细胞（P＜0．01）。结论 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体的建立及稳定高表达KLK7的前列腺癌单克隆细胞株的建立,为研究KLK7在前列腺癌发生发展中的作用提供了条件。     

pcDNA3.1-CD81载体在人肝癌细胞中的表达及意义

目的研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA3．1-CD81在人肝癌细胞系HepG2中的表达及意义。方法由人Molt-4细胞提取细胞总RNA，根据已公布的序列设计引物，运用RT-PCR及PCR方法扩增出人CD81基因，应用TA克隆插入PMD-18T载体；定向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )；通过脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2，用免疫组织化学方法(ABC法)及流式细胞技术检测目的蛋白的表达。结果由RT-PCR及PCR方法扩增出入CD81编码基因与Genebank公布的序列完全一致。重组真核表达载体pcDNA3．1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确。免疫组织化学方法(ABC法)及流式细胞技术证明转染的HepG2细胞表面能有效地表达CD81蛋白。结论所构建的pcDNA3．1-CD81真核表达载体在HepG2细胞有良好的表达，该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供细胞模型，为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础。     

转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的作用,探讨其在食管癌基因治疗中的可行性和特异性.方法:在食管癌细胞系EC9706中转染kiss-1基因,经G418筛选,建立稳定高表达Kiss-1蛋白的细胞系.稳定表达该基因的细胞为转染kiss-1基因组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型;监测肿瘤生长变化,HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、Western blot方法检测kiaa-1 mRNA和蛋白变化.结果:转染kiss-1基因组肿瘤生长受到显著抑制:HE染色显示转染kiss-1基因组及转染空质粒纽肿瘤组织内坏死均较空白对照组多;RT-PCR、Western blot结果表明转染kiss-1基因组裸鼠肿瘤组织kiss-1 mRNA和蛋白表达均显著升高,三组间比较差异具有统计学意义(F=72.685,24.807,均P<0.05).结论:转染kiss-1基因能抑制人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,且能有效上调kiss-1 mRNA和蛋白的表达,可为食管癌的基因治疗提供新的靶点、开辟新的思路.     

Expression of angiostatin cDNA in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and its effect on implanted carcinoma in nude mice

AIM: To transfect murine angiostatin cDNA into human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and to investigate its effects on implanted carcinoma in nude mice. METHODS: A eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-mAST containing murine angiostatin was constructed. Then pcDNA3.1-mAST plasmid was transfected into cell line SMMC-7721 by Lipofectamine. The resistant clone was screened by G418 filtration and identified by RT-PCR and Western blotting. Nude mice were divided into three groups of 10 each. Mice in blank control group were only injected with SMMC-7721 cells. Mice in vector control group were injected with SMMC-7721 cells transfected with pcDNA3.1 (+) vector, whereas mice in angiostatin group were injected with SMMC-7721 cells transfected with pcDNA3.1-mAST plasmid. Volume, mass and microvessel density (MVD) of the tumors in different groups were measured and compared. RESULTS: Murine angiostatin cDNA was successfully cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+). pcDNA3.1-mAST was successfully transfected into SMMC-7721 cell line and showed stable expression in this cell line. No significant difference was observed in the growth speed of SMMC-7721 cells between groups transfected with and without angiostatin cDNA. Tumor volume, mass and MVD in the angiostatin group were significantly lower than those in the blank control group and vector control group (P<0.01). The inhibitory rate of tumor reached 78.6%. Mass and MVD of the tumors only accounted for 34.6% and 48.9% respectively of those in the blank control group. CONCLUSION: Angiostatin cDNA could be stably expressed in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 without obvious inhibitory effects on the growth of SMMC-7721 cells. When implanted into nude mice, SMMC-7721 cells transfected with angiostatin cDNA show a decreased tumorigenic capability. It suggests that angiostatin can inhibit tumor growth through its inhibition on angiogenesis in tumors.     

Effect and mechanism of the Twist gene on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells

AIM： To study the effect of the transfected Twist gene on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells and the possible mechanisms involved. METHODS： Human gastric carcinoma MKN28 cells were stably transfected with Twist sense plasmid, and MKN45 cells were stably transfected with Twist antisense plasmid using the lipofectamine transfection technique. RT-PCR, Western blotting, EMSA, gelatin zymography assay, and in vitro invasion and migration assays were performed. Nude mice metastasis models were established by the abdominal cavity transfer method. RESULTS： Cell models （TwistS-MKN28） that steadily expressed high Twist protein were obtained. Compared with MKN28 and pcDNA3-MKN28 cells, adherence, migration and invasion ability of TwistS -MKN28 cells were clearly raised. The number of cancer nodules was increased significantly in the abdominal cavity and liver of nude mice inoculated with TwistS-MKN28 cells. Overexpression of Twist in MKN28 cells increased Tcf-4/ Lef DNA binding activity, and promoted expression of Tcf-4’s downstream target genes cyclin D1 and MMP-2. However, suppression of Twist （TwistAS-MKN45） inhibited MKN45 cell invasion and the expression of cyclin D1 was reduced. The activity of MMP-2 was also decreased. CONCLUSION： These results indicate that Twist promotes gastric cancer cell migration, invasion and metastasis, and Twist may play an important role in Wnt/ Tcf-4 signaling.     

pEGFP-C1-反义生存素重组质粒的构建和转染

目的 构建pEGFP-C1-反义生存素（survivin)重组质粒，并转染入人MKN-45低分化胃腺癌细胞株，观察转染前后生存素基因的表达及对凋亡的影响。从基因水平探讨反义生存素核酸治疗胃癌的分子生物学机制。为今后利用反义基因治疗肿瘤提供实验和理论依据。方法 应用基因重组技术构建 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒，通过脂质体转染法转染人MKN-45胃腺癌细胞株，以流式细胞仪方法检测细胞凋亡，以RT-PCR技术检测质粒转染前后生存素基因mRNA的表达。结果 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒转染MKN-45低分化胃腺癌细胞株后细胞凋亡明显增加，G2/M期细胞减少，同时生存素基因在mRNA水平被抑制。结论 反义生存素核酸能抑制细胞增殖。减少生存素基因的mRNA表达而促进胃癌细胞凋亡。     

Bax基因对人胃癌耐药细胞多药耐药性的逆转作用

目的 研究凋亡相关基因Ｂax对胃癌多药耐药细胞的多药耐药性的逆转作用。方法 构建含有人Ｂax cＤＮＡ全长的真核表达载体pＢＫ－Ｂax,经脂质体导入缺乏Ｂax蛋白表达的人 胃癌多药耐药细胞系ＳＧＣ７９０１/ＶＣＲ中。Ｗestern印迹观察Ｂax基因在转导细胞中的表达,ＭＴＴ法检测Ｂax转导细胞与空载体转导细胞对化疗药物的敏感性。结果 成功构建了Ｂax的真核表达载体,Ｂav转导细胞能稳定表达Ｂax蛋白,与空载体转导细胞相比。Ｂ