二苯乙烯苷对H2O2诱导的MC3T3-E1凋亡的保护作用及机制研究

目的研究二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)对氧化应激导致的成骨前体细胞MC3T3-E1凋亡的保护作用,并初步探讨相关机制。方法不同浓度TSG预处理MC3T3-E1 24 h后,300μmol/L H_2O_2作用24 h。实验分组:①空白对照组;②单纯H_2O_2处理组;③H_2O_2+TSG 0.1μmol/L处理组;④H_2O_2+TSG 1μmol/L处理组;⑤H_2O_2+TSG 10μmol/L处理组;⑥阳性对照抗氧化剂NAC 1 mmol/L处理组,通过MTT法、Hoechst33258染色来评价细胞凋亡情况及TSG对氧化损伤的保护作用;利用荧光酶标仪和MDA检测试剂盒来检测细胞中ROS及MDA的水平来评价细胞的氧化应激状态;Western-blot和RT-PCR分别从蛋白水平和基因水平评价Bcl-2和Bax的表达水平。结果单纯H_2O_2处理可以导致细胞死亡,显微镜下可见许多细胞死亡,脱壁;Hoechst33258染色可见有较多的细胞出现核固缩、核浓集现象;不同浓度的TSG预处理后,细胞凋亡现象得到改善。单独H_2O_2作用可以导致成骨前体细胞出现较大程度的凋亡,不同浓度TSG预处理后,细胞凋亡率有所降低;单纯H_2O_2作用可以导致细胞水平的ROS和脂质氧化产物MDA产生增加,TSG(1～10μmol/L)可以显著降低细胞水平ROS和MDA水平(P0.05),改善细胞的氧化应激状态;Western-blotting和实时定量RT-PCR结果 TSG预处理可以减少H_2O_2处理后,促凋亡蛋白Bax的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论氧化应激可以导致成骨前体细胞MC3T3-E1凋亡增加,TSG可以通过降低氧化应激水平。其机理可能是TSG通过促凋亡蛋白Bax的表达及增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达起到保护作用。     

褪黑素对老化卵母细胞体外发育能力的改善效果评价

目的探讨体外培养阶段(IVC)添加褪黑素(MT)对卵母细胞老化引起发育受损的改善效果。方法采用不同浓度的过氧化氢(H_2O_2)处理小鼠MII期卵母细胞诱导老化,浓度分别为0(对照组)、10、50、100、150μmol/L,体外受精(IVF)后统计各组二细胞率、囊胚形成率,检测老化卵母细胞的线粒体活性及丰度(Mitotracker Red、JC-1)、活性氧(ROS)水平、线粒体拷贝数等指标;在100μmol/L H_2O_2处理条件下,老化卵母细胞在IVF后的培养阶段分别添加不同浓度褪黑素(10-5、10-7、10-9 mol/L),统计二细胞率、囊胚率,并且分别检测各组获得囊胚的细胞数及凋亡率。结果不同浓度H_2O_2诱导卵母细胞老化后,囊胚发育率随H_2O_2浓度的升高而降低,50μmol/L和100μmol/L H_2O_2组囊胚形成率分别为(26.27±0.06)%和(28.46±3.45)%,相比对照组的(34.90±1.77)%显著降低,差异有统计学意义(P0.05);在H_2O_2诱导老化卵母细胞中,100μmol/L、150μmol/L H_2O_2浓度时,ROS水平相比对照组显著升高,差异具有统计学意义(P0.05);而活性线粒体的丰度及拷贝数呈现下降趋势,膜电位呈上升趋势,但相比对照组无显著性差异(P0.05);100μmol/L H_2O_2处理诱导卵母细胞老化后,在培养液中添加10-9 mol/L褪黑素组与老化对照组相比,囊胚率[(29.42±2.39)%vs.(20.87±4.12)%]、囊胚细胞数(39.36±9.78vs.37.91±4.25)均显著升高,凋亡率显著下降(2.57%vs.3.18%),差异均有统计学意义(P0.05);并且这些指标均达到与未经老化处理组的相似发育水平。结论老化卵母细胞体外受精后发育率和发育质量偏低的现象,可以通过在受精后体外培养阶段添加褪黑素得到改善。     

阿魏酸调控AMPK通路对过氧化氢诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用研究

目的观察阿魏酸(FA)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的肠上皮屏障损伤保护作用,并初步探讨其作用机制。方法体外培养Caco-2细胞,建立肠上皮屏障模型,随机分为对照组、H_2O_2组、10 μmol/L FA组、20 μmol/L FA组、40 μmol/L FA组、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂组、FA+AMPK抑制剂组。噻唑蓝(MTT)实验和乳酸脱氢酶(LDH)法检测Caco-2细胞存活和损伤情况;跨上皮电阻(TEER)测定各组评估肠上皮屏障功能变化;丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测各组肠上皮屏障氧化应激状态变化;Western blotting法检测各组肠上皮屏障闭塞蛋白(Occludin)、紧密连接小带闭塞蛋白1(ZO-1)和p-AMPK蛋白表达情况;免疫荧光法观察各组肠上皮屏障中Occludin和ZO-1蛋白分布及变化情况。结果与对照组相比,H_2O_2组Caco-2细胞存活率、TEER值、SOD活性、Occludin、ZO-1和p-AMPK蛋白表达显著降低(P0.05),LDH活力、MDA表达显著升高(P0.05);与H_2O_2组相比,10 μmol/L FA组、20 μmol/L FA组和40 μmol/L FA组Caco-2细胞存活率、TEER值、SOD活性、Occludin、ZO-1和p-AMPK蛋白表达依次升高(P0.05),LDH活力、MDA表达依次降低(P0.05),AMPK抑制剂组上述指标变化呈完全相反趋势。共聚焦显微镜观察显示,对照组ZO-1和Occludin蛋白沿细胞膜均匀分布,呈连续网状结构;H_2O_2组ZO-1和Occludin蛋白分布杂乱;AMPK抑制剂组蛋白分布进一步杂乱,结构破坏严重;40 μmol/L FA组ZO-1和Occludin蛋白分布趋于均匀;FA+AMPK抑制剂组ZO-1和Occludin蛋白分布连续性稍有恢复。结论 FA可能通过激活AMPK信号通路,发挥对肠上皮屏障功能的保护作用。     

ERK信号通路在右美托咪定减轻小鼠神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤中的作用

目的观察右美托咪定对过氧化氢(H_2O_2)所致小鼠神经母细胞瘤细胞(mouse neuroblastoma N2acells,N2a)氧化应激损伤的影响,探讨ERK信号通路的作用。方法在N2a细胞培养基中加入一定浓度的H_2O_2建立N2a细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为五组:对照组(C组)、右美托咪定组(D组)、H_2O_2组(H组)、H_2O_2+右美托咪定组(HD组)、H_2O_2+右美托咪定+ERK抑制剂组(HDP组)。H组、HD组和HDP组给予200μmol/L的H_2O_2,HD组在H_2O_2处理前30min加入100ng/ml右美托咪定,HDP组在H_2O_2处理前30 min加入100ng/ml右美托咪定和20μmol/LERK抑制剂PD98059,D组在相应时点加入100ng/ml右美托咪定,C组给予等容量生理盐水。在H_2O_2刺激1h,检测细胞上清SOD活性,并分析ERK磷酸化水平;H_2O_2刺激4h,观察细胞生存、细胞形态学变化。结果与C组比较,H组N2a细胞生存率明显降低,细胞形态明显损伤,SOD活性明显下降(P0.05);与H组比较,HD组的细胞生存率明显升高,细胞形态明显改善,SOD活性明显升高,ERK磷酸化水平明显增强(P0.05);与HD组比较,HDP组细胞生存率明显降低,细胞形态明显恶化,SOD活性明显降低(P0.05)。C组和D组细胞生存率、细胞形态、SOD活性及ERK磷酸化水平差异无统计学意义。结论右美托咪定预处理能够减轻H_2O_2所致的N2a细胞氧化应激损伤,其机制可能是通过激活细胞内ERK信号通路和提高SOD活性。     

糖尿病条件下钛-骨界面氧化应激对血管内皮细胞功能的影响及机制研究

目的研究在糖尿病条件下过度产生的活性氧簇(ROS)对钛-骨界面的血管内皮细胞功能的影响,并初步探讨改善血管内皮细胞功能以保持内植物稳定的方法。方法通过将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)种植于钛片培养,建立体外模型,比较正常血清组(NS组),糖尿病血清组(DS组),DS+NAC(ROS抑制剂,20 mmol/L)组,NS+H_2O_2(300μmol/L)组血管内皮细胞的生物学功能、氧化应激水平及炎症介质水平。结果培养后第1、4、7天,DS组的细胞增殖活力明显低于NS组,DS+NAC组中细胞增殖活力较DS组显著提高但仍低于NS组,NS+H_2O_2组细胞增殖活力明显低于其他3组,差异均有统计学意义(P0.05)。DS组MDA含量明显高于NS组,Mn SOD酶活性更低,早期细胞凋亡率更高,TNF-α含量更高。DS加入NAC之后,DS+NAC组MDA含量下降明显,Mn SOD酶活性升高,早期细胞凋亡率较显著下降,TNF-α含量明显降低,差异均有统计学意义(P0.05)。在NS组中加入H_2O_2后,血管内皮细胞功能受损,氧化应激和炎症反应水平明显升高。结论糖尿病环境造成钛-骨界面血管内皮细胞氧化应激,过度产生ROS,对血管内皮细胞功能造成明显损伤,而抗氧化治疗可有效改善血管功能状态。     

过氧化氢对小鼠睾丸支持细胞损伤机制的代谢组学研究

目的:应用基于气相色谱联用质谱(GC-MS)的代谢组学技术研究小鼠睾丸支持细胞氧化应激损伤机制。方法:以过氧化氢(H_2O_2)干预小鼠睾丸支持细胞TM4细胞,建立氧化损伤细胞病理模型。分别采用MTT方法检测存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡率,荧光分光光度计检测细胞内活性氧(ROS)水平;同时通过GCMS检测H_2O_2干预后各组细胞内源性代谢物的指纹图谱。结果:成功建立H_2O_2损伤模型,600μmol/L H_2O_2干预2 h后细胞存活率降至50%左右;低(100μmol/L)、中(300μmol/L)和高(600μmol/L)H_2O_2剂量组总凋亡率分别为(19.45±0.53)%、(20.12±0.58)%和(37.13±0.35)%,均显著高于不加H_2O_2的空白对照组[(10.28±0.35)%,P均0.05];中、高H_2O_2剂量组ROS水平[(1.27±0.10)%、(2.07±0.09)%]也显著高于对照组[(1.00±0.08)%,P0.05、P0.01];代谢组学结果显示:与对照组相比,高剂量组细胞内氨基酸类、糖类等代谢水平均出现明显变化,其中缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、阿拉伯糖、果糖、5-羟色胺和胆固醇等在内的15种代谢物差异显著(VIP1,P0.05)。结论:睾丸支持细胞在H_2O_2干预后产生的损伤或凋亡与细胞内的氨基酸代谢、糖代谢和能量代谢密切相关。     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P0.05),D组低于C组(P0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

高雄激素促进人胚胎干细胞向男性原始生殖细胞分化的研究

目的:多囊卵巢综合征(PCOS)母亲孕早期的高雄激素可能影响其男性子代成年后的生育力。本研究利用人胚胎干细胞(hESCs)体外分化的实验模型,观察不同浓度睾酮对hESCs向早期雄性生殖细胞分化的影响,探讨孕早期高雄激素暴露对男性子代原始生殖细胞储备及成年后生育力的潜在影响。方法:2μmol/L视黄酸(RA)体外诱导hESCs(46,XY)向雄性生殖细胞分化,同时添加0 mol/L、3×10~(-7) mol/L、5×10~(-7) mol/L、15×10~(-7) mol/L、45×10~(-7) mol/L、135×10~(-7) mol/L睾酮,在分化的第0、4、7、14天收集细胞样品,分析不同分化阶段雄性生殖细胞特异基因的表达,比较分化进程、分化效率。结果:不同浓度睾酮处理的hESCs,同一分化阶段细胞形态无差异。原始生殖细胞的标志基因DAZL的表达峰值出现在分化的第4天,15×10~(-7) mol/L、45×10~(-7) mol/L、135×10~(-7) mol/L睾酮处理组的DAZL的表达量与3×10~(-7) mol/L睾酮处理组对比明显增加(P﹤0.01)。减数分裂期早期生殖细胞特异基因SCP3的表达在分化的第4天开始上调,45×10~(-7) mol/L睾酮处理组与3×10~(-7) mol/L、5×10~(-7) mol/L睾酮处理组比较,SCP3的表达均明显上调(P﹤0.01);SCP3的表达在分化的第7天达到峰值,15×10~(-7) mol/L、45×10~(-7) mol/L、135×10~(-7) mol/L睾酮处理组与3×10~(-7) mol/L睾酮处理组相比,SCP3明显高表达(P﹤0.01)。免疫荧光、流式细胞分析结果显示,各组间分化第4天DAZL、分化第7天SCP3及VASA的表达量随着睾酮浓度升高而有升高趋势。分化第4天,雄激素受体(AR)的表达开始升高,并且可维持至分化第14天;在相同分化阶段,睾酮较高浓度组hESCs的AR表达量高于睾酮较低浓度组(但P>0.05)。结论:hESCs向早期雄性生殖细胞分化过程中高雄激素处理,诱导雄激素受体的提前表达,使hESCs向早期雄性生殖细胞分化提前,可能导致PCOS患者男性子代雄性原始生殖细胞储备不足,进而影响其成年后的生育力。hESCs可作为体外模型研究PCOS患者宫内高雄激素暴露对其男性子代生育力影响研究的新工具,并有益于男性不育症病因机制的研究。     

人参皂苷Rb2保护关节软骨细胞对抗氧化应激的作用机制研究

[目的]探讨人参皂苷Rb2对过氧化氢(H_2O_2)诱导的兔软骨细胞凋亡的保护作用机制。[方法]采用体外培养兔关节软骨细胞,传至第2代后进行实验。随机分为:对照组、H_2O_2组、Rb2+H_2O_2组。应用cck-8检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测相关基因的表达,western blot检测Bax和Bcl-2的表达。[结果]与正常组相比H_2O_2组的细胞凋亡率显著增高,并且在400μmol/L作用24 h时最显著;Rb2处理后显著抑制了软骨细胞的凋亡,增高了Bcl-2/Bax的比值。[结论]人参皂苷Rb2能够抑制活性氧堆积引起的线粒体途径的凋亡来保护关节软骨细胞免受氧化应激引起的损伤。     

复合成骨诱导剂对骨髓基质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨复合成骨诱导剂对骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的影响。方法:选取2月龄SD雄性大鼠2只,处死后冲洗股骨,胫骨骨髓腔获得骨髓组织,采用贴壁培养法纯化大鼠BMSCs,并进行原代和传代培养。取第三代BMSCs,将细胞分A~G 7个组,A组为对照组:在不含任何诱导剂的培养基内培养;B组为常规诱导组:在仅含有诱导剂(10.0mmol/β-甘油酸钠,10~(-8)mol/L地塞米松,50mg/L抗坏血酸)的培养基内培养;C,D,E,F,G组为复合诱导组,在含有复合诱导剂(常规诱导剂+阿仑膦酸钠)的培养基内培养,其中阿仑膦酸钠的浓度分别是10~(-6)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-9)mol/L、10~(-10)mol/L。观察细胞贴壁生长增殖及形态变化,western-blot法检测骨形态发生蛋白(BMP-2)的表达。结果:观察发现各组细胞贴壁生长良好,呈长梭形,细胞均存活,E组细胞体积变得肥大,长出多个胞浆突起呈多角形,细胞周围可见云雾状分泌物。A组中细胞呈长梭形增殖,形态未见明显变化,分泌物最少。各周各组western检测发现BMP-2表达量顺序均如下:10~(-8)mol/L组10~(-7)mol/L组10~(-9)mol/L组10~(-6)mol/L组10~(-10)mol/L组常规诱导组空白对照组。结论:阿仑膦酸钠在低浓度(10~(-8)mol/L)时对骨髓基质干细胞成骨分化具有促进作用。     

Faculty of Anaesthetists of the Royal College of Surgeons of Ireland

The Faculty of Anaesthetists of the Royal College of Surgeons of England, 35–43 Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PN. Telephone: 01-405 3474.     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。