转染 p53基因对肺腺癌细胞株裸鼠 移植瘤生长的影响

目的：探讨转染野生型 p53（ wt-p53）和突变型 p53（ mt-p53）基因对人肺腺癌细胞株 GLC-82裸鼠移植瘤生长的影响。方法：采用脂质体介导法,分别将 wt-p53和 mt-p53基因导入人肺腺癌细胞株 GLC-82,在裸鼠体内、体外实验中检测转导细胞的生长状况和裸鼠致瘤性。结果：转染 mt-p53 基因的细胞株 G418筛选的细胞集落数、 3H-TDR掺入实验、软琼脂平皿细胞集落数,以及裸鼠瘤组织重量和体积均高于对照组（ P<0.01）,而转染 wt p53基因的细胞株均显著低于对照组（ P< 0.01）,表明导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度明显低于对照组细胞株和导入 mt p53基因的细胞株,即导入 mt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最快,而导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最慢。结论： wt p53基因能有效抑制人肺腺癌细胞生长; mt p53基因则可以明显地促进瘤细胞生长。     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞生长及药物敏感性影响

目的：探讨野生型p53基因转染对人卵巢癌细胞株SKOV-3的体外生长及裸鼠体内致瘤性抑制作用。并了解p53基因与SKOV-3细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导,将含有人野生型p53cDNA的真核表达质粒pCB6-p53导入SKOV-3细胞中,观察该细胞体外生长和裸鼠体内致瘤性改变;应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,MTT法检测细胞药物敏感性改变。结果：免疫组化法证实外源性p53基因在阳性细胞克隆稳定存在;转染野生型p53基因的SKOV-3细胞体外生长速率下降,裸鼠体内致瘤性丧失;G1/G0期细胞百分比（81.5%)和凋亡细胞百分比（11%）增高;p53表达阳性的SKOV-3细胞对顺铂的敏感性明显增强。结论：野生型p53基因转染能使SKOV-3细胞出现生长抑制和对顺铂的化疗敏感性增强。     

多聚乙烯基亚胺介导的pOSP1-HSVtk基因对卵巢癌的抗瘤研究

目的: 研究多聚乙烯基亚胺(PEI)介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌的抗肿瘤作用.方法:(1)将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk利用PEI导入人卵巢癌细胞SKOV3,人肺癌细胞NCI-H460和人肝癌细胞HepG2,MTT法测定GCV对三种肿瘤细胞的杀伤作用;(2)建立卵巢癌移植瘤模型,瘤周注射PEI/pOSP1-HSVtk复合物,通过HPLC监测体内GCV浓度的变化来评价TK基因在肿瘤组织中的表达效率;同时记录裸鼠的体重、瘤体大小及瘤重,计算体积和重量抑瘤率,并进行肿瘤组织的病理学和TUNEL检测.结果: (1)GCV仅对SKOV3细胞具有杀伤作用;(2)与对照组相比,GCV的浓度在转染pOSP1-HSVtk的肿瘤组织局部显著降低(0.05>P>0.01);治疗组的肿瘤体积和瘤重显著减小(P<0.01),体积抑瘤率与重量抑瘤率分别为63.66%和58.98%.组织学示治疗组肿瘤细胞有出血及坏死,TUNEL证实了细胞的凋亡.结论: 多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有靶向杀伤作用.     

HC3898基因的初步功能研究

目的：初步研究HC3898基因的功能。方法：通过细胞集落形成实验、裸鼠成瘤实验和计算机分析对HC3898基因的功能进行初步研究。结果：HC3898在蛋白质水平与酵母、果蝇、线虫中一些与细胞生长分化相关的蛋白质有很高的同源性。HC3898全长cDNA克隆转染SMMC－7721细胞能显著抑制集落的形成。 转染HC3898基因的SMMC－7721细胞在裸鼠中的抑瘤率为50％,统计学差异显著。常规病理切片显示实验组瘤中坏死灶内可见较多凋亡细胞及凋亡小体,在未坏死区可见散在凋亡细胞及凋亡小体。TUNEL染色证明有较多凋亡细胞。抽提实验组瘤块的组织DNA,经1．5％琼脂糖电泳分析,可发现典型的凋亡“阶梯状DNA条带”。结论：HC3898可能通过诱导细胞凋亡而抑制SMMC－7721细胞的生长,提示它是细胞生长分化相关的基因。     

肿瘤相关新基因HC90的表达差异及初步功能研究

目的 对新基因克隆HC90进行蛋白表达、各种肿瘤组织和细胞系中表达差异检测和体内外功能研究。方法 用pET-32a表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中对该基因进行表达,免疫小鼠制备小鼠源性多克隆抗体;从体外细胞集落形成试验,裸鼠体内成瘤实验,原位杂交,免疫细胞化学及免疫组化检测HC90基因的表达差异和对体内外细胞生长影响的生物学功能进行研究。结果 SMMC7721细胞系的体外集落形成试验表明。结果 SMMC7721细胞系的体外集落形成试验表明,HC90转染组与空载体组和p53对照组相比集落形成数显著增加（P＜0．05和P＜0．01）;转染细胞系的裸鼠体内成瘤实验结果表明该基因对L929细胞系的成瘤有明显促进作用（P＜0．05）;免疫组化结果显示HC90在人多种肿瘤组织,癌旁和正常组织中均有不同程度的表达,总体上表现为癌组织＞癌旁组织＞正常组织。结论 HC90是个新的肿瘤相关基因。     

多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究

背景与目的目前基因治疗领域的关键技术问题是如何提高基因载体的转导效率和靶向性。近年来以一种新的多聚阳离子化合物—多聚乙烯基亚胺(polyethylenimine,PEI)作为载体为基因转移提供了一条有效的新思路。本研究应用PEI介导卵巢特异性启动子OSP-1调控下的自杀基因HSV-tk体外处理人卵巢癌细胞SKOV3,观察其抗瘤效应和靶向性。方法(1)将pGL3-Luc质粒分别介导多聚乙烯基亚胺PEI、脂质体DOTAP和裸DNA转染人卵巢癌细胞SKOV3,检测荧光素酶表达RLU(relativeluciferaseunit);(2)利用PEI将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk导入人卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞SMMC7721,应用MTT法测定更昔洛韦(ganciclovir,GCV)对两种肿瘤细胞的毒性;高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测GCV在SKOV3的细胞内代谢;流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶原位标记(TdT-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡。结果(1)PEI组的荧光素酶表达活性最高(187.35±6.48),与另两组相比(45.74±5.98,0.03±0.00),有显著性差异(P<0.01);(2)GCV对SKOV3细胞呈现明显的细胞毒性,对SMMC7721细胞没有产生细胞毒性;HPLC检测显示随着作用时间的延长,细胞内GCV水平逐渐下降;流式细胞仪显示转染pOSP1-HSVtk质粒的SKOV3细胞经GCV作用24、48、72h后,凋亡率分别为(8.42±0.76)%、(18.50±1.78)%、(34.80±3.46)%,呈明显的增高趋势;TUNEL检测SKOV3细胞可见大量凋亡细胞。结论多聚乙烯基亚胺介导卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有特异的体外杀伤作用,有助于提高基因治疗的有效性和靶向性。     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞生长及药物敏感性影响

目的:探讨野生型p53基因转染对人卵巢癌细胞株SKOV-3的体外生长及裸鼠体内致瘤性抑制作用,并了解p53基因与SKOV-3细胞对顺铂敏感性之间的关系.方法:利用脂质体介导,将含有人野生型p53cDNA的真核表达质粒pCB6-p53导入SKOV-3细胞中,观察该细胞体外生长和裸鼠体内致瘤性改变;应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,MTT法检测细胞药物敏感性改变.结果:免疫组化法证实外源性p53基因在阳性细胞克隆稳定存在;转染野生型p53基因的SKOV-3细胞体外生长速率下降,裸鼠体内致瘤性丧失;G1/G0期细胞百分比(81.5%)和凋亡细胞百分比(11%)增高;p53表达阳性的SKOV-3细胞对顺铂的敏感性明显增强.结论:野生型p53基因转染能使SKOV-3细胞出现生长抑制和对顺铂的化疗敏感性增强.     

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的〖HT5”SS〗： 构建表达新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞 SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 以野生型鸡痘病毒（fowl poxvirus, FPV）282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5溴2脱氧尿苷（5bromo2deoxyribouridine,BrdU）加压法筛选重组体,并通过RTPCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝（methylthiazoletetrazolium,MTT）染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43.37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20.65%。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。     

造影剂微泡介导WT-p53基因靶向治疗肝癌的实验研究

目的 评估超声造影剂介导WT-p53基因靶向治疗肝癌的疗效,以寻找一种无创、高效、无毒的靶向基因导入技术。方法 首先制备裸鼠肝癌皮下模型,然后将48只荷瘤裸鼠分成4组,第1组注入p53质粒;第2组注入p53质粒后超声辐照;第3组注射造影剂+p53质粒;第4组瘤体内注入造影剂+p53质粒后,超声辐照瘤体。利用RT-PCR、Western blot检测p53基因和蛋白在组织中的表达情况。结果 RT-PCR检测各实验组细胞内均有p53 mRNA的表达。注入超声造影剂与未注入相比,经超声照射,第4组WT-p53在肝癌细胞中的表达明显高于其他对照组(P＜0.05)。结论 超声辐照下,造影剂结合的含WT-p53基因质粒可靶向性促进WT-p53基因在肝癌细胞中的表达。     

非病毒载体系统在基因治疗中的应用

非病毒载体系统具有低毒、低免疫原性和相对靶向性等优点,是新兴发展起来的基因转移系统.本文综述了目前基因治疗中所用的几种非病毒载体系统及其研究进展.     

HSV1-tk基因在肿瘤报告基因显像与治疗中的研究进展

自杀基因疗法是一种有潜在临床应用价值的肿瘤治疗策略。HSV1-tk基因兼具治疗基因和报告基因的功能，可用于基因显像、基因治疗及其疗效监测。近年来，无创伤性的肿瘤HSV1-tk基因显像发展很快，核素标记的显像底物有FIAU、FMAU、FHBG和FHPG等，使用的显像设备有PET、SPECT或γ照相机等，这些显像方法具有不同的敏感性和特异性，但均能监测动物体内表达HSV1-tk肿瘤部位的增殖情况和治疗效果，更复杂的HSV1-tk报告基因显像方案正在探索中。HSV1-tk基因治疗联合靶向治疗、放射治疗、药物治疗、免疫生物治疗、热疗及其他基因治疗具有疗效相加或协同效应，增强了对肿瘤的杀伤作用。     

MLL-mediated transcriptional gene regulation investigated by gene expression profiling

The human mixed lineage leukemia (MLL) gene is involved in about 50 different chromosomal translocations, associated with the disease phenotype of acute leukemia. However, the normal function of MLL is less understood. Homozygous knockouts of murine Mll were embryonal lethal, while heterozygous disruption led to aberrant hox gene expression associated with skeletal malformations, growth retardation, and impaired hematopoiesis. To understand MLL functions on the molecular level, gene expression profiling experiments were performed with a pair of murine cell lines (MLL(+/+) and MLL(-/-)). Microarray hybridization experiments revealed 197 potential target genes that are differentially expressed, providing new and important clues about MLL functions.     

Light-induced adenovirus gene transfer, an efficient and specific gene delivery technology for cancer gene therapy

A main issue for further clinical progress of cancer gene therapy is to develop technologies for efficient and specific delivery of therapeutic genes to tumor cells. In this work, we describe a photochemical treatment that substantially improves gene delivery by adenovirus, one of the most efficient gene delivery vectors known. Transduction of two different cell lines was studied by microscopy, flow cytometry, and an enzymatic assay, employing a beta-galactosidase-encoding adenovirus. The photochemical treatment induced a >20-fold increase in gene transduction, compared with conventional adenovirus infection, both when measured as the percentage of cells transduced, and when measured as the total beta-galactosidase activity in the cell population. The effect was most pronounced at lower virus doses, where in some cases the same transduction efficiency could be achieved with a 20 times lower virus dose than with conventional infection. Photochemical treatments are already in clinical use for cancer therapy, and generally are very specific and have few side effects. The photochemical internalization technology described thus has a clear potential for improving both the efficiency and the specificity of gene delivery in cancer gene therapy, making it possible to achieve efficient site-specific in vivo gene delivery by adenoviral vectors.     

抗肿瘤基因疫苗

肿瘤基因疫苗的发展逐渐趋于成熟,常见基因疫苗主要有细胞因子类基因疫苗、多基因联合疫苗,转染基因的树突状细胞疫苗等.近些年肿瘤基因疫苗的发展逐渐趋向于寻找基凶疫苗佐剂或探索不同基凶的联合从而达到更加有效地治疗目的.     

bcr-abl和白介素-7共表达基因疫苗诱导小鼠免疫保护作用

目的探讨小鼠白介素-7（IL-7）基因对bcr-abl融合基因疫苗诱导机体免疫应答的影响。方法采用pVbcr-abl／mIL-7质粒免疫BALB／c小鼠,检测小鼠血清中bcr-abl特异性抗体水平。以转染bcr-abl融合基因片段的SF2／0细胞为靶细胞,用LDH释放实验检测免疫小鼠脾细胞特异性细胞毒活性。结果pVbcr-abl／mIL-7质粒能诱导小鼠产生血清特异性抗bcr-abl抗体,pVbcr-abl／mIL-7免疫组的血清特异性抗体滴度高于pVbcr-abl免疫组,脾细胞杀伤SP2／0／bcr-abl靶细胞的细胞毒活性明显增强。结论共表达bcr-abl和mIL-7的基因疫苗能在小鼠体内诱导较高的特异性体液免疫和细胞免疫水平,为慢性粒细胞白血病基因疫苗的临床前实验研究提供了依据。     

Saporin as a novel suicide gene in anticancer gene therapy

We used a non-viral gene delivery approach to explore the potential of the plant saporin (SAP) gene as an alternative to the currently employed suicide genes in cancer therapy. Plasmids expressing cytosolic SAP were generated by placing the region encoding the mature plant ribosome-inactivating protein under the control of cytomegalovirus (CMV) or simian virus 40 (SV40) promoters. Their ability to inhibit protein synthesis was first tested in cultured tumor cells co-transfected with a luciferase reporter gene. In particular, SAP expression driven by CMV promoter (pCI-SAP) demonstrated that only 10 ng of plasmid per 1.6 x 10(4) B16 cells drastically reduced luciferase activity to 18% of that in control cells. Direct intratumoral injection of pCI-SAP complexed with either lipofectamine or N-(2,3-dioleoyloxy-1-propyl) trimethylammonium methyl sulfate (DOTAP) in B16 melanoma-bearing mice resulted in a noteworthy attenuation of tumor growth. This antitumor effect was increased in mice that received repeated intratumoral injections. A SAP catalytic inactive mutant (SAP-KQ) failed to exert any antitumor effect demonstrating that this was specifically owing to the SAP N-glycosidase activity. Our overall data strongly suggest that the gene encoding SAP, owing to its rapid and effective action and its independence from the proliferative state of target cells might become a suitable candidate suicide gene for oncologic applications.     

Inactivation of the murine N-ras gene by gene targeting.

The mammalian ras genes have been implicated in the genesis of a wide variety of tumors. Although it is likely that they play an essential role in signal transduction, their specific function is still unknown. To initiate a genetic analysis of the ras genes in mammals we inactivated the N-ras gene in murine embryonic stem cells by gene targeting. The frequency of integration at the N-ras locus of our targeting vector being low (of the order of 1/5000 transfectants), we used a positive/negative selection followed by an analysis of individual colonies in order to minimize the in vitro manipulation of the embryonic stem cells. Using this approach, we isolated two clones of ES cells with one inactivated N-ras allele. These cells have no distinctive phenotype either in vitro or in vivo in chimeric mice.