梓醇促大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的机制研究

目的:探讨梓醇促SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)骨向分化的作用机制。方法:(1)细胞分为对照组、成骨诱导组及梓醇组。4-氨基安替吡啉测酚法检测诱导第7、14和21天各组细胞上清碱性磷酸酶(ALP)活性,ALP染色法检测诱导第14天各组细胞ALP阳性染色率,茜素红染色法检测诱导第21天各组细胞矿化结节数;(2)运用real-time PCR法检测诱导第7、14和21天各组细胞中Runx2、骨钙素(osteocalcin)、β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt3a、Wnt5a及Wnt11的mRNA表达水平。结果:(1)2.0 mg/L梓醇可增加BMSCs上清中ALP活性及细胞ALP的阳性染色率,同时促进BMSCs矿化结节的形成(P0.05)。(2)梓醇促BMSCs骨向分化时,Runx2的mRNA表达水平于第14天时达到峰值,随后开始下降,第21天时与对照组无统计学差异;osteocalcin的mRNA相对表达量在第7天时高于对照组,随后持续上升直至第21天。(3)与对照组相比,梓醇促BMSCs骨向分化时,β-catenin与Wnt3a的mRNA相对表达量均于第14和21天时升高并维持在较高水平,而Wnt5a及Wnt11的mRNA相对表达量在第14天达到峰值后开始下降,第21天时Wnt11 mRNA相对表达量显著低于对照组。结论:梓醇通过上调Runx2的表达,促使BMSCs向成骨细胞方向分化,同时还通过增加细胞ALP分泌及osteocalcin的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟,此作用可能与其有序激活Wnt信号通路相关。     

丙戊酸孤独症大鼠脑中经典Wnt信号通路的变化

 目的：探讨经典Wnt信号通路在孤独症发病中的作用。方法：利用丙戊酸孤独症大鼠模型,检测经典Wnt信号通路信号分子在孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区的表达。Western blotting法检测糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、磷酸化GSK-3β、β-catenin和磷酸化β-catenin表达,半定量RT-PCR法检测GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclin D1 mRNA表达。结果：与对照组相比,在丙戊酸孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区,失活的GSK-3β磷酸化表达显著增加,抑制性的β-catenin磷酸化表达显著减少;GSK-3β mRNA表达减少,β-catenin mRNA表达增加,下游c-Myc和cyclin D1 mRNA表达增加。结论：前额叶皮质及海马中经典Wnt信号通路活性增加可能促进了机体对孤独症的易感性。     

舒林酸对丙戊酸孤独症动物模型大鼠氧化应激变化的影响

 目的:探讨舒林酸对孤独症发生过程中氧化应激变化的影响。方法: 利用丙戊酸（VPA）孤独症动物模型,检测经典Wnt信号通路特异性抑制剂舒林酸处理后经典Wnt信号通路及氧化应激标志物在孤独症模型大鼠前额叶皮质及海马脑区的表达变化。Western blotting法检测糖原合成激酶3β（GSK-3β）、β-catenin和4-羟基壬烯醛（4-HNE）表达,半定量RT-PCR法检测硫氧还蛋白（Trx）1和Trx2 mRNA表达。结果: 与对照组相比,在前额叶皮质及海马脑区VPA组GSK-3β蛋白表达减少,Trx1和Trx mRNA 表达减少,β-catenin与4-HNE的表达增加;而与VPA组相比,VPA与舒林酸同时处理组GSK-3β的表达显著增加,β-catenin和4-HNE的表达显著减少。结论: 舒林酸减少了孤独症发生过程中氧化应激的产生,提示经典Wnt信号通路上调导致氧化应激产生,进而导致孤独症易感性增加。     

Wnt/β-catenin信号通路对孤独症模型大鼠重复呆板样行为的影响

目的　探讨Wnt/β-catenin信号通路对孤独症发生过程中重复呆板样行为的影响。 方法　利用丙戊酸（valproic acid,VPA）孤独症动物模型,检测了经典Wnt信号通路关键信号分子β-catenin及其负性调节因子GSK-3β在孤独症模型大鼠小脑脑区的表达变化;同时检测孤独症模型大鼠重复呆板样行为变化。Western blotting法检测GSK-3β、β-catenin总蛋白及磷酸化蛋白表达,运用旷场实验检测重复呆板样行为持续的时间、次数。 结果　与对照组相比,在小脑脑区模型组GSK-3β磷酸化蛋白表达增加,β-catenin磷酸化蛋白表达减少;重复呆板样行为持续的时间、次数均增加。 结论　孤独症大鼠小脑脑区经典wnt信号通路活性增加,运动亢进,提示经典Wnt信号通路活性增加可能导致重复呆板样行为变化,进而导致对孤独症的易感性增加。     

TGFBR1基因调控Wnt/β-catenin信号通路对结缔组织病相关的肺间质病变中抗纤维化的机制研究

目的：探讨TGF-β受体Ⅰ（TGFBR1）基因调控Wnt/β-catenin信号通路对结缔组织病相关的肺间质病变（CTD-ILD）的抗纤维化作用。方法：以肺癌的癌旁组织作为正常对照组,Western blot检测CTD-ILD患者肺组织TGFBR1的蛋白表达;人胚肺成纤维细胞系MRC-5分为空白对照组、TGF-β1组、阴性对照组和TGFBR1-siRNA组,各组细胞培养48 h,Western blot检测TGFBR1、Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cad）及Wnt/β-catenin信号通路β 连环蛋白（β-catenin）和c-Myc的蛋白表达;CCK8法检测各组细胞的活力。结果：TGFBR1在CTD-ILD肺组织中的表达显著高于正常肺组织（P<0.05）;与空白对照组比较,TGF-β1组细胞活力、TGFBR1、Ⅰ型胶原、CTGF、α-SMA、β-catenin和c-Myc的蛋白表达均显著升高,E-cad蛋白表达显著降低（P<0.05）;TGF-β1组和阴性对照组细胞活力、TGFBR1、Ⅰ型胶原、CTGF、α-SMA、E-cad、β-catenin和c-Myc的蛋白表达差异均无统计学意义（P＞0.05）;与TGF-β1组比较,TGFBR1-siRNA组细胞活力、TGFBR1、Ⅰ型胶原、CTGF、α-SMA、β-catenin和c-Myc的蛋白表达均显著降低,E-cad蛋白表达显著升高（P<0.05）。结论：TGFBR1基因在CTD-ILD肺组织中表达升高,抑制TGFBR1的表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路降低CTD-ILD纤维化的发生。     

Wnt在胰岛素抵抗大鼠海马Aβ沉积中的作用及罗格列酮治疗前后Aβ的变化

目的: 探讨经典Wnt通路中的配体Wnt3a及下游胞内的β-catenin与胰岛素抵抗(IR)大鼠模型海马中β淀粉样肽(Aβ)沉积的关系;观察IR模型大鼠经罗格列酮治疗后,上述各指标的改变及与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)的相关性。方法: 高糖、高脂、高蛋白饮食3个月造IR大鼠模型(IR),给予罗格列酮灌胃4周为治疗组(TZD);葡萄糖氧化酶法检测大鼠血糖水平,放免法检测血浆胰岛素水平,HOMA-IR评估胰岛素抵抗水平,蛋白印迹技术检测大鼠海马内Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPARγ的水平。结果: IR组血浆胰岛素水平及胰岛素抵抗程度显著高于对照组。免疫印迹结果显示,IR组大鼠海马中Aβ及β-catenin表达增加,Wnt3a及PPARγ表达明显减少;经TZD干预后,大鼠海马中Aβ表达减少,Wnt3a、β-catenin及PPARγ表达增加。结论: 胰岛素抵抗大鼠海马内Wnt信号通路水平下降可能是导致Aβ沉积的原因。罗格列酮作为PPARγ激动剂,可通过上调Wnt通路活性从而减少IR大鼠海马内Aβ的沉积。     

下调MARCH8基因的表达对宫颈癌Siha细胞侵袭、迁移与增殖的影响

目的：研究下调MARCH8基因表达对人宫颈癌Siha细胞侵袭、迁移、增殖以及克隆的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：构建特异性针对MARCH8基因的siRNA片段,并将其通过脂质体介导转染至宫颈癌Siha细胞,同时设立转染无义序列的阴性对照组。分别采用Real-time PCR法与蛋白质印迹法检测转染后,细胞中MARCH8在mRNA和蛋白水平上的表达改变。通过Transwell小室实验、划痕实验检测MARCH8表达下调对细胞侵袭、迁移能力的影响,通过CCK-8法、细胞平板克隆实验检测MARCH8表达下调对细胞增殖、克隆形成能力的影响,并采用蛋白质印迹法检测MARCH8基因表达下调对基质金属蛋白酶9（MMP9）,波形蛋白（Vimentin）以及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。最后采用蛋白质印迹法检测MARCH8基因表达下调,对Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin以及E钙黏蛋白（E-cadherin）表达的影响。结果：与转入siRNA-NC组相比,转入siRNA-MARCH8组细胞MARCH8在 mRNA和蛋白表达水平上均明显降低,细胞的侵袭、迁移以及增殖和克隆形成能力明显被抑制（P<0.05）,且侵袭标记蛋白MMP9,Vimentin以及增殖标记蛋白PCNA的表达也明显下降。MARCH8基因表达成功下调后,转入siRNA-MARCH8组细胞中β-catenin蛋白的表达水平较阴性对照组明显下降（P<0.05）,而E-cadherin蛋白的表达水平明显升高（P<0.05）。结论：下调MARCH8基因的表达可以抑制宫颈癌Siha细胞的侵袭、迁移、增殖和克隆能力,其机制可能与Wnt/β-catenin通路的抑制有关。     

梓醇调控Hedgehog信号通路促进BMSCs向成骨分化的实验研究

目的观察梓醇对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并从Hedgehog信号角度探讨其可能的作用机制。方法体外分离培养BMSCs,并通过流式细胞仪对细胞加以鉴定。pNPP法筛选梓醇最佳促BMSCs骨向分化的浓度,以最佳梓醇浓度干预BMSCs的成骨性分化。后续实验分4组:对照组、梓醇组、经典组和联合组(梓醇组+经典组)。酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色法检测矿化结节数目,QPCR法检测Shh mRNA、Ihh m RNA水平,Western blot法检测Ptch1、Smo及Gli1蛋白的表达。结果梓醇促BMSCs骨向分化的最佳浓度为1×10-4mol/L;与对照组比较,梓醇组的ALP活性显著增强,矿化结节数目显著升高,Shh mRNA水平显著上升,Ptch1、Smo及Gli1蛋白表达均显著升高(P0.05);与经典组比较,梓醇组的ALP活性、矿化结节数目、Shh m RNA水平、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达均低于经典组(P0.05);各组中Ihh mRNA水平无明显变化。结论梓醇能够促进BMSC向成骨分化,可能与上调Hedgehog信号传导通路相关分子有关。     

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Wnt信号通路的影响

背景：尿酸作为一种内源性的抗氧化剂,其抗氧化、抗DNA 损害作用及发挥促成骨作用近年受到关注。目的：探讨不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin 信号通路相关基因表达的影响。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养健康成年人骨髓间充质干细胞,培养至第3代时,用含不同浓度尿酸(0,140,280,560 μmol/L)的成骨诱导液进行成骨向诱导分化培养,检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性、增殖能力以及Wnt信号通路中Wnt-3α,β-catenin mRNA的表达。结果与结论：各组细胞碱性磷酸酶染色为阳性,尿酸干预后各组细胞碱性磷酸酶活性和增殖能力增高,Wnt信号通路相关基因Wnt-3a、β-catenin的表达上调,且呈现浓度依赖性,各指标在实验组与对照组间比较以及实验组组间比较,差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果显示尿酸可通过促进Wnt-3a/β-catenin信号通路进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖和分化,具有浓度依赖性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Zeste基因增强子同源物2通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)通过调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:以RT-q PCR和Western blot检测胶质瘤U87、H4和U251细胞及正常人脑星形细胞(NHA)中EZH2的表达水平。在H4细胞中转染EZH2 siRNA和siRNA control,MTT测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,分光光度计法检测caspase-3的活性,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)和下游靶分子c-Myc的蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理转染EZH2 siRNA的H4细胞,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定β-catenin和c-Myc的表达。结果:胶质瘤U87、H4和U251细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平均明显高于NHA(P0.05),并且H4细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平高于U87和U251细胞(P0.05)。EZH2 siRNA可以明显下调H4细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平。EZH2表达下调后的H4细胞从48 h开始细胞活力降低,并且细胞凋亡率也明显升高,细胞中caspase-3活性也明显升高(P0.05),同时EZH2表达下调还可以抑制β-catenin和c-Myc的表达。Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可以减少EZH2诱导的H4细胞凋亡,降低细胞中caspase-3的活性。结论:EZH2在脑胶质瘤细胞中过度表达,下调其表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而诱导胶质瘤细胞凋亡。     

siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响

 目的:研究小干扰RNA(siRNA) 干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33 ℃条件下传代培养足细胞,在37 ℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转染分化成熟的小鼠足细胞,用MTT法测定细胞活力,用实时qRT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达。结果:RNA干扰WT1可诱导小鼠足细胞Wnt1 mRNA和蛋白表达上调,p-β-catenin水平降低及足细胞活力下降,伴有足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达明显下调。结论: 沉默WT1基因的表达可诱导足细胞活力下降和nephrin表达下调,可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

干扰Yes相关蛋白表达调控Wnt/β-catenin信号通路影响膀胱癌细胞凋亡

目的:探讨干扰Yes相关蛋白(YAP)的表达对膀胱癌细胞凋亡的影响及机制。方法:以膀胱癌细胞T-24为研究对象,分为正常对照(control)组、siRNA阴性对照(siRNA-NC)组和YAP siRNA组。分别以real-time PCR和Western blot实验检测转染后各组细胞中YAP的mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测β-连环蛋白(β-catenin)和c-Myc表达水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理YAP siRNA组细胞,并用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:YAP siRNA组YAP的mRNA和蛋白水平均明显低于control组(P0.05)。YAP siRNA组的细胞活力及c-Myc和β-catenin水平均明显低于control组(P0.05),而细胞凋亡率明显高于control组(P0.05)。与未经FH535处理的YAP siRNA组细胞相比,YAP siRNA组的细胞经FH535处理后细胞活力明显下降,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰YAP表达能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活而抑制膀胱癌细胞活力,并促进膀胱癌细胞凋亡。     

乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达及意义

目的:本研究旨在探讨乳腺癌组织和细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin的表达及意义。方法:选取我院于2015年1月~2017年1月间收治的150例乳腺癌患者作为研究对象。150例乳腺癌的肿瘤组织样本(实验组)来源于手术切除的、临床病理资料保存完整的乳腺癌石蜡切块;相应的临近非肿瘤组织样本(对照组)取自距离肿瘤组织0.5~1 cm的上述乳腺癌患者相应癌旁组织。采用real-tme PCR和Western blot法检测Wnt-1和β-catenin的表达情况。将乳腺癌细胞MCF-7分为3组:阴性对照组(MCF-7细胞)、激动剂组[MCF-7细胞+Wnt3a(1 mg/L)]和拮抗剂组[MCF-7细胞+DKK1(16μmol/L)]。采用real-time和Western blot检测Wnt-1和β-catenin表达情况。结果:与对照组相比,实验组患者Wnt-1和β-catenin的mRNA和蛋白表达量均升高(P0.05)。实验组患者肿瘤组织的Wnt-1表达阳性率和β-catenin表达阳性率均高于对照组(P0.05)。Wnt-1表达与乳腺癌患者肿瘤转移(x~2=5.352,P=0.021)、肿瘤分期(x~2=9.412,P=0.002)及肿瘤直径(x~2=9.412,P=0.002)密切相关(P0.05)。β-catenin表达与乳腺癌患者肿瘤转移(x~2=9.851,P=0.002)、肿瘤分期(x~2=5.661,P=0.017)密切相关(P0.05)。与对照组相比,激动剂组Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表达量升高(P0.05);与对照组相比,拮抗剂组Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表达量降低(P0.05)。结论:乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin表达上调,且其表达与肿瘤恶性状态密切相关。     

RNA 干扰抑制BAG-1 基因表达对皮肤鳞状细胞癌增殖及凋亡的影响研究

目的:探讨抑制BAG-1(Bcl-2-associated athanogene-1)基因表达对皮肤鳞状细胞癌增殖及凋亡的影响。方法:采用LipofectamineTM2000 将BAG-1 的siRNA 转染皮肤鳞状细胞癌A431,转染后48 h,RT-PCR 检测BAG-1 的mRNA 表达,Western blot 检测BAG-1 的蛋白表达;CCK8 和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况;Western blot 检测B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bcl-2)家族促凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及Wnt/β-catenin 信号通路β-连环蛋白(β-catenin)、Survivin 的蛋白表达;ELISA 试剂盒检测白介素6 (IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)含量。结果:与空白组和阴性对照组比较,转染BAG-1 的siRNA 可明显抑制BAG-1 在转录和翻译水平上的表达;与空白组较,BAG-1-siRNA 组细胞增殖显著降低,细胞凋亡率显著增加,Bax 蛋白表达上调, β-catenin、Survivin 蛋白表达下调,IL-6、VEGF 含量均显著降低(P<0.05)。结论:BAG-1 表达沉默可降低皮肤鳞状细胞癌增殖,促进细胞凋亡,上调Bax 及下调Wnt/ β-catenin 信号通路表达,降低IL-6、VEGF 因子的分泌。     

下调TPD52基因表达通过Wnt信号通路对子宫肌瘤细胞活力、凋亡及TNF-α和IL-6表达的影响

目的:探讨下调肿瘤蛋白D52(TPD52)基因表达通过Wnt信号通路对子宫肌瘤细胞活力、凋亡及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)表达的影响。方法:将针对TPD52的特异性si RNA(si-TPD52)及其阴性对照转染原代培养的子宫肌瘤细胞,并加入Dickkopf-1(DKK1)作为Wnt信号通路抑制剂,转染48 h后,用Western blot检测TPD52及Wnt信号通路关键分子β-catenin和相关靶蛋白cyclin D1和survivin的蛋白表达; MTT及流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率的变化; RT-qPCR检测TNF-α和IL-6的m RNA表达。结果:TPD52在转染si-TPD52的子宫肌瘤细胞的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P 0. 05);与阴性对照组比较,si-TPD52组细胞活力明显受到抑制,凋亡率增加,TNF-α的m RNA表达降低,IL-6的m RNA表达升高,β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表达降低(P 0. 05);加入DKK1后si-TPD52对细胞活力和凋亡的影响更明显。结论:下调TPD52基因表达可通过Wnt信号通路抑制子宫肌瘤细胞生长和诱导凋亡,同时下调TNF-α和上调IL-6表达。     

ILK siRNA对高糖刺激的人肾小管上皮细胞GSK-3β及β-catenin表达的影响*

 目的：探讨高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中整合素连接激酶小干扰RNA（ILK siRNA）对糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化和β-连环蛋白（β-catenin）核内表达的影响及意义 。方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞系HKC,分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高糖＋阴性转染对照组 (HG+HK)和高糖＋ILK siRNA组(HG+ILK siRNA)。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。RT-PCR及Western blotting检测ILK  mRNA及蛋白表达水平;免疫细胞化学检测磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）和β-catenin表达。Western blotting检测总GSK-3β、p-GSK-3β、核β-catenin、总β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。结果：（1）倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,证实构建的siRNA重组质粒成功转染HKC细胞;（2）与HG和 HG+HK组相比,HG+ILK siRNA组ILK mRNA及蛋白水平下降,但较NG组表达仍高;（3）HG+ILK siRNA组ILK基因沉默后,p-GSK-3β与核β-catenin蛋白表达较HG及HG+HK组均下降,但较NG组表达仍高。而总GSK-3β与总β-catenin 在各组表达无明显差异。结论:ILK、GSK-3β和β-catenin可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。ILK可能通过调节Wnt/β-catenin途径下游效应蛋白GSK-3β和β-catenin的表达而促使肾小管上皮细胞转分化。