日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆

目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2 (SjCL2 )的编码区基因序列 ,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法　用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA ,RT -PCR扩增目的基因 ,将扩增产物定向克隆到真核表达载体 pcDNA3中。 结果　RT -PCR特异性扩增出SjCL2编码区基因序列 ,其片段大小为1kb左右 ,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA -SjCL2中含有所扩增的基因序列。 结论　RT -PCR扩增的SjCL2编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含SjCL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA -SjCL2。     

日本血吸虫Calpain序列分析及DNA疫苗体系的构建

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子 -钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)在抗日本血吸虫感染的保护性作用及其保护性免疫机制。方法　从日本血吸虫成虫中提取RNA ,用RT -PCR扩增Calpain含多个B ,T细胞表位的片段 ,引物中包含BamHI和EcoRI的酶切位点 ,PCR扩增产物经纯化后TA克隆 ,转化的阳性TA克隆经PCR筛选后 ,液体培养大肠杆菌并回收质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,目的基因亚克隆到真核表达质粒pVAC载体 ,构建 pVAC -Cal pain真核表达体系 ,转化的阳性亚克隆经PCR筛选 ,液体培养大肠杆菌并回收pVAC -Calpain质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定被亚克隆的Calpain基因。 结果　RT -PCR从日本血吸虫RNA中扩增了 4 5 3bp的Calpain基因 ,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定Calpain基因被克隆到真核表达质粒 pVAC载体。 结论　日本血吸虫疫苗候选分子Calpain的DNA疫苗体系的建立将有助于解析这个疫苗候选分子抗日本血吸虫感染的保护性免疫作用及保护性免疫机制。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的编码区全序列分析及克隆

目的 分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因编码区的完整序列,并定向克隆到真核表达质粒pcD-NA3中。 方法 从日本血吸虫成虫提取总RNA,进行反向巢式RT-PCR,T载体克隆后测序。PCR扩增SjCL1基因的编码区序列,并将扩增产物克隆到pcDNA3质粒的BamHI和Xhol位点上。结果 通过反向巢式RT-PCR扩增出332 bp SjCL1基因5’端序列,测序后与报道的SiCL1基因部分序列拼接,可得到一个编码317个氨基酸的完整编码区序列。PCR特异性扩增出SjCL1编码区基因序列,其大小约为1 kb。经酶切、PCR鉴定和测序表明所构建的质粒pcDNA-SjCL1中含有所扩增的基因序列。 结论 构建了含SjCL1基因的编码区序列的真核表达质粒pcDNA-SjCL1。     

汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码核蛋白的S基因,将扩增产物分别与pGEM-T-Easy载体连接,经序列分析后双酶切,分别定向克隆入载体pPICZαΑ和pPICZαC,继而将重组质粒以SacⅠ线性化并电转化入毕赤酵母X33感受态细胞,用Zeocin筛选高拷贝转化子进行鉴定。结果PCR扩增产物约为1290bp,与T载体相连测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.84%和99.92%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得pPICZα-ΑZ10S和pPICZ-αL99S,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10S和PpX33-L99S,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HIN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。     

甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的 将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株.方法 通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI 和KpnI 酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33.用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株.结果 经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆.SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68 kD.结论 成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

巢式RT-PCR分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)的基因5''末端序列

目的：测定日本血吸虫组织蛋白酶L1（SjCL1)基因的5'端序列。方法：从日本血吸虫成虫中提取总RNA，以该RNA为模板，进行巢式RT－PCR，扩增SjCL1基因5'端序列。将其与pMD18-T载体连接得到含SjCL1基因5' 端序列的重组质粒，并测定上述DNA插入片段的序列。结果：通过巢式RT－PCR扩增出332bp SjCL1基因5'端序列，测序后，与报道的SjCL1基因部分序列拼接后，可得到一个编码317个氨基酸的完整开放阅读框。结论：使用巢式RT－PCR技术，扩增得到SjCL1基因的5'端序列。为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

弓形虫P30与佐剂CTA2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30-CTX 蛋白奠定基础. 方法 PCR 扩增P30-CTX 复合基因,产物回收后与pMD-18T 载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-P30-CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1 313 bp 的P30-CTX 基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA-P30-CTX.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.使用生物信息软件分析P30-CTX 复合基因,预测编码蛋白结构.结果重组质粒经PCR 可得1 313 bp 的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1 313 bp和3 085 bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP-P30-CTX 基因,序列分析同源性为99.82%,P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变. 结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX 的抗原性不会产生影响.     

结核分枝杆菌Rv0577基因在毕赤酵母的表达及重组抗原活性鉴定

目的在毕赤酵母表达结核分枝杆菌Rv0577基因并鉴定重组蛋白抗原活性。方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv扩增Rv0577基因,TA克隆进入pGEM-TEasy载体,再亚克隆进入pPICZαA。重组质粒pPICZαA-Rv0577经双酶切鉴定并测序证实,线性化后电转化导入毕赤酵母X-33表达;采用Western blot和Dot blot鉴定抗原活性。结果双酶切及测序鉴定均证实获得Rv0577基因的正确克隆。pPICZαA-Rv0577在X-33分泌表达的目的蛋白,通过硫酸铵沉淀、HPLC顺序纯化,获得的纯化蛋白与结核病患者血清进行Dot blot,7份中有3份反应阳性。结论Rv0577基因在毕赤酵母获得高效表达,重组抗原可被结核病患者血清识别,具有抗原活性。     

日本血吸虫信号转导分子14-3-3蛋白epsilon亚型基因的克隆与序列分析

目的：克隆日本血吸虫14－3－3蛋白epsilon亚型的编码基因，以研究其在血吸虫信号传导及其在免疫预防的作用。方法：以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链，设计合成引物,用PCR法扩增14－3－3蛋白epsilon亚型基因编码序列，将其克隆人pGEM-T载体，并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果：RT－PCR扩增出一条约753bp大小的特异性条带，重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT－PCR扩增出大小相同条带，序列测定结果表明其具有753bp的开放阅读框，并具蛋白激酶、酪氨酸激酶磷酸化位点。结论：成功构建了日本血吸虫14－3－3蛋白epsilon亚型重组pGEM-T克隆载体，为进一步的研究提供了条件。     

Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达

目的　克隆 2型登革病毒E基因并用酵母真核表达 ,获得全长的重组E蛋白 ,为其结构与功能的研究提供条件。方法　从感染DEN2 (NGC株 )后病变的C6 /36细胞上清中提取RNA ,通过RT -PCR扩增E基因片段 ,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒 ,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定 ,取Mut+菌诱导表达 ,SDS -PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果　RT -PCR得到 1 5kb的E基因片段 ,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因 ;Mut+ 酵母转化菌可分泌表达约 6 9kDa的蛋白 ,与DEN2E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论　成功将克隆的全长DEN2E基因在酵母菌中表达 ,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。　方法　通过PCR从质粒pcDNA3-SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T -1中 ,构建重组质粒pGEX-SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM109,转化子经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。　结果　获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX-SjCL1质粒。SDS-PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。　结论　SjCL1基因在大肠埃希菌中以融合形式得到表达。     

旋毛虫Ts87抗原基因在毕赤酵母中的构建及表达

目的构建旋毛虫Ts87抗原基因并在毕赤酵母中分泌表达。方法通过PCR特异性扩增Ts87抗原基因,构建重组质粒P^PICZαA-Ts87。其线性化后,转化毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。表型鉴定后进行甲醇诱导表达,收集培养不同天数的上清液。斑点杂交法分析上清液以确定有无重组蛋白分泌表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析鉴定表达蛋白。结果与结论成功构建了P^PICZαA-Ts87毕赤酵母表达重组质粒,确定了Ts87抗原基因在毕赤酵母中获得分泌表达。     

蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因的酵母表达载体构建

目的构建蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因,将其克隆到甲醇酵母,建立分泌表达载体pPIC9K。方法设计、合成蜱抗凝血肽与RGDS肽的双功能分子的重组基因,对人工合成的目的基因片段进行酶切、测序鉴定。运用PCR技术,扩增目的基因,PCR产物经胶回收后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PCR、酶切鉴定和DNA测序证明双功能基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便、高效地获得所需的多拷贝基因,为下一步在毕赤酵母中表达双功能分子蛋白建立了基础。     

结核分枝杆菌MPT64在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆结核分枝杆菌MPT64基因全长，构建毕赤酵母分泌型表达载体，获得表达MPT64的重组毕赤酵母工程菌。方法利用PCR技术扩增MPT64基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZotA中；将正确的表达载体线性化后，电击导人到毕赤酵母GS115中，Zeocin^TM抗性筛选正确的重组子；SDS—PAGE及Western-blot鉴定分泌表达MPT6d的重组毕赤酵母。结果克隆获得了正确的MPT64酵母分泌表达载体，并获得了相应的重组酵母株，该重组子经甲醇诱导培养后能分泌大小约30kDa的蛋白，该蛋白能特异地与His抗体结合。结论本实验获得了酵母重组的结核杆菌MPT64蛋白，为探讨其生物学性能和临床上的应用奠定了实验基础。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫SCP/TAPS基因家族的生物信息学分析和克隆表达

目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白进行生物信息学分析,经PCR确定后,以AAW24579为代表进行进一步的研究,将其命名为SjVAL2。根据SjVAL2的序列设计引物,通过RT-PCR扩增出全长编码区域,克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,免疫印迹实验（Western-blotting）鉴定纯化的重组蛋白。结果日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,多序列比对分析发现它们初步可以分为3个不同的亚组。以日本血吸虫成虫cDNA为模板RT-PCR扩增出SjVAL2序列,PCR、双酶切及DNA测序均证实pET-28a（＋）-SjVAL2重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌中获得高效表达,重组蛋白能识别日本血吸虫感染的小鼠血清,说明其具有免疫反应性。结论日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,其中SjVAL2基因可在原核表达系统中高效表达,为进一步研究该家族蛋白的功能打下基础。