流体切应力作用强度对内皮细胞IL一8生成的影响

血管内皮细胞衬于血管腔的表面,是血流机械应力的主要感受者.切应力可以直接调节内皮细胞生物活性物质的合成和分泌,其中包括诱导内皮细胞生成IL一8,而且IL一8的生成量与切应力作用时间有关.为阐明内皮细胞IL一8的生成除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关,我们用不同强度的流体切应力(2.09、4.61、6.1 9、8.51、10.50、12.59、14.41、17.22、18.32 dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞,然后采用双抗体夹心ABC-ELISA技术检测内皮细胞IL一8蛋白质的生成.结果显示未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL一8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.09dyne/cm2)时IL一8蛋白质生成量明显增加,约为高切应力(18.32 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的6(作用5 h)或7倍(作用6 h).IL一8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数γ=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数γ=-0.980.式中y为切应力作用下内皮细胞IL-8的生成量;x为施加于内皮细胞的切应力强度(dyne/cm2).不同的切应力作用时间(5 h、6 h)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞生成IL一8的量,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的生成量与切应力强度有关.流体低切应力诱导内皮细胞IL-8的生成量急剧增高,可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用.     

流体切应力对内皮细胞IL-8基因表达的影响及信号转导

目的流体切应力对于维持血管的稳定有着重要的作用.另外在一些病理情况下,例如动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发病过程中,流体切应力也扮演着关键角色.我们以往的实验结果证实:以低流体切应力(4.2dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞1 h,其IL-8mRNA的表达上调;处理2 h其表达量上调更为明显.在本实验中我们将进一步阐明流体切应力对培养的人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达、蛋白生成的影响及其信号转导途径.方法分别用实时定量RT-PCR及定量三明治ELISA检测IL-8基因表达及蛋白生成;通过基因转染及流式细胞数检测IL-8报告基因pEGFP1-IL8USCS经流体切应力作用后的激活情况;用免疫荧光化学染色观测对照和层流切应力处理以后NF-κB核转移情况;将对照和层流切应力处理后的内皮细胞裂解物进行I-κB和磷酸化的I-κB的免疫印迹实验,以检测切应力诱导的I-κB磷酸化和降解的情况;RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色观察TLR-4和TLR-2在人脐静脉内皮细胞上的表达;用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDNA3,构建重组TLR-4胞内缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4,与pEGFP1-IL8USCS共转染内皮细胞,流式细胞术观察mTLR4对切应力诱导IL-8报告基因表达的影响.结果和讨论(1)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,1 h IL-8 mRNA表达增加,2 h IL-8 mRNA表达量至最高值,3 h IL-8 mRNA表达量开始下降,4 h后IL-8 mRNA持续相对高表达;各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 mRNA随时间的变化规律,即IL-8的表达对切应力有时间依赖性.(2)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,低切应力时IL-8 mRNA表达量明显增加,高切应力时IL-8 mRNA表达量较低.IL-8 mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;不同的切应力作用时间(1、2 h)均表现出相同的IL-8 mRNA随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的表达量与切应力作用强度有关,两者之间具有明显的直线负相关.直线回归方程:1 h时为y=7.57-0.11x,相关系数r=-0.97;2 h时为y=7.92-0.10 x,相关系数r=-0.96.(3)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞1 h后,IL-8蛋白质生成量增加,处理5 h后IL-8蛋白质生成量增加至最高值,处理8 h后IL-8蛋白质生成量下降,10 h后IL-8蛋白质生成量维持在一个较高的水平.各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力作用时间的变化规律.提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成IL-8,并且IL-8的生成量与切应力的作用时间有关,呈双相性变化.(4)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.23 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(19.29 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h)或7倍(作用6h).IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数r=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数r=-0.980.(5)pEGFP1-IL8USCS转染细胞,层流切应力刺激3 h后IL-8报告基因绿色荧光蛋白表达增强.(6)NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示,切应力刺激0.5 h,胞核即出现阳性反应,刺激1.5 h后,胞核呈强阳性染色.(7)细胞裂解物免疫印迹显示,刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强,1 h后磷酸化IκB印迹强度降到无,而IκB随刺激时间延长而逐渐降低,0.5和1 h后降至测不到IκB.(8)免疫荧光细胞化学染色显示脐静脉血管内皮细胞膜表达TLR-4.RT-PCR和Northern杂交显示,人脐静脉血管内皮细胞表达TLR-2和TLR-4 mRNAs;当切应力刺激1 h后,TLR-4 mRNA表达明显增强.pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.本实验中我们采用的切应力为2.23、4.20、6.08 dyne/cm2,这些切应力与动脉血管分叉处等低切应力区生理切应力大小相似,在这些低切应力区,血管内皮细胞可分泌IL-8,IL-8转而激活中性粒细胞和单核细胞,调控它们和内皮细胞的黏附,这将触发一系列的病理变化,例如:动脉粥样硬化等.结论流体切应力诱导内皮细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8蛋白的生成,在感染及动脉粥样硬化等病理过程中扮演着重要角色.     

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8生成的影响

内皮细胞对力学刺激反应敏感 ,流体切应力可以直接调节内皮细胞生物活性物质的产生。为阐明内皮细胞白细胞介素 - 8(IL- 8)蛋白质的生成受力学因素的影响 ,本文用流体切应力 (2 .0 9、4 .6 1、6 .19dyne/cm2 )处理培养的人脐静脉内皮细胞 ,然后采用双抗体夹心 ABC- EL ISA技术检测内皮细胞 IL- 8蛋白质的生成。结果显示 :未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的 IL- 8蛋白质生成 ;切应力处理内皮细胞 1h,IL- 8蛋白质生成增加 ,处理 5 hIL- 8蛋白质生成量至最高值 ,处理 8h IL- 8蛋白质生成量下降 ,10 h后 IL- 8蛋白质维持在一个较高的水平 ;各实验组 (2 .0 9、4 .6 1、6 .19dyne/cm2 )均表现出相同的 IL- 8蛋白质随力学刺激时间的变化规律。提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成 IL- 8,并且 IL- 8的生成量与切应力的作用时间有关 ,呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞生成 IL- 8,可能在急性炎症或动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用     

流体切应力强度对内皮细胞IL-8基因表达的影响

内皮细胞位于血流与血管之间，内皮细胞调控的机械力相关反应已成为正常血管反应的一部分。切应力在调节内皮细胞功能上具有重要作用。流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达，其中包括诱导内皮细胞表达IL－8，而且IL－8的表达量与切应力作用时间有关。 为阐明内皮细胞IL－8基因的表达除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关，我们用不同强度的流体切应力（2．23、4．20、6．08、8．19、9．67、12．15、14．40、16．87、19．29dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用定量RT－PCR的方法检测内皮细胞IL－8 基因的表达情况。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞没有IL－8基因的表达，切应力处理内皮细胞后，低切应力（2．23dyne/cm^2）时IL－8mRNA表达量明显增加为高切应力（19．29dyne/cm^2）时IL－8mRNA表达量的约68（作用1小h）或52倍（作用2h）。IL－8mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应务强度呈反变关系，直线回归方程，1h时为y=7.57-0.11x，相关系数r=7.97;2h时为y=7.92-0.10x，相关系数r＝0．96。式中：y为切应力作用下内皮细胞IL－8mRNA的表达量（拷贝数的对数值）；x为施加于内皮细胞的切应力强度（dyna/cm^2)。不同的切应力作用时间（1h,2h）均表现出相同的IL-8mRNA随切应力强度的变化规律。提示流体应力诱导内皮细胞表达IL－8，不仅与切应力的作用时间有关，而且IL－8的表达量与切应力强度有关。流体切应诱导内皮细胞IL－8mRNA的表达急剧增高，可能在炎症机制和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8 基因表达的影响

内皮细胞对力学环境变化敏感，流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达。为阐明内皮细胞白细胞介素-8（IL-8）基因的表达除受化学因子的调节外还受力学因素的影响，本文用流体切应力（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用定量RT-PCR的方法检测内皮细胞IL-8基因的表达情况。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达；切应力处理内皮细胞后，1h IL-8mRNA表达增加，2hIL-8mRNA表达量至最高值，3hIL-8mRNA表达量开始下降，4h后IL-8mRNA持续低表达；各实验组（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）均表现出相同的IL-8mRNA随时间的变化规律。提示流体切应力确可诱导内皮细胞表达IL-8，而且IL-8的表达量与切应力作用时间有关，呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8，可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

流体低切应力对内皮细胞IL—8mRNA表达的影响

为证实内皮细胞IL-8表达不仅受化学因子的调节,而且还受力学因素的影响。我们用低层流切应力（4.2dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞后采用RT-PCR法检测内皮细胞IL-8基因表达,并用免疫细胞化学染色法检测内皮细胞内NF-kB激活的影响,结果发现：①未用切应力处理和切应力作用0.5h后内皮细胞IL-8mRNA表达量很少,切应力作用1h后内皮细胞IL-8 mRNA表达增加,2h进一步增加。②未用切应力处理和切应力作用0.5h内皮细胞核内NF-kBp65染色阴性,切应力作用1h呈弱阳性,2h呈阳性。提示低层流切应力可诱导内皮细胞表达增加,IL-8表达量与切应力作用时间有关。流体切应力可诱导内皮细胞内NF-kB的激活,激活程度与作用时间有关。低切应力诱导内皮细胞表达IL-8,可能在急性炎症和动脉粥样硬化发生、发展过程中具有重要作用。     

基因突变和转基因技术评价TLR-4信号受体在流体切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因转录激活中的作用

用基因突变和转基因技术，评价TLR-4信号受体在层流低切应力刺激诱导血管内皮细胞IL-8基因转录激活中的作用，RT-PCR，Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色均显示脐静脉血管内皮细胞表达TLR-4，同时RT-PCR和Northern杂交显示，层流切应力刺激1h后血管内皮细胞TLR-4表达增强，用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增出胞内区段缺失突变TLR-4cDNA，用PCR技术从其基因组DNA中扩增出IL-8上游调控序列，分别克隆于真核表达质粒pcDNA3和绿色荧光增强蛋白报告基因pEGFP1质粒，构建出重组TLR-4缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4和IL-8报告基因表达质粒pEGFP1-IL8USCS。用pEGFP1-IL8USCS转染或pcD-NA3-mTLR4和pEGFP1-IL8USCS共转染ECV304细胞，4.2dyne/cm^2层流切应力刺激3h后，流式细胞仪观察荧光蛋白表达强度变化，用pEGFP1-IL8USCS转染细胞，经层流切应力刺激3h后荧光蛋白表达增强（1.06:2.71)，同样用pcDNA3-mTLR4和pEGFP1-IL8USCS共转染细胞，层流切应力刺激3h后荧光蛋白表达未明显增强，提示TLR4/NF-кB信号传导通路可能介导层流切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因的表达。     

流体切应力对内皮细胞粘附分子表达的影响

在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生发展中各种白细胞,包括单核细胞对内皮细胞的粘附可能起着较为重要的作用。在体内,血流切应力对内皮细胞的形态和功能有重要影响。为了阐明流体切应力对内皮细胞表面粘附分子表达的影响,本文研究了流体切应力(2.23～6.08dyne/cm     

流体切应力对人内皮细胞迁移和整合素基因表达的影响

目的研究流体切应力空间梯度和均匀切应力对内皮细胞（ECs）迁移和整合素基因表达的影响，为阐明应力诱导血管重建的分子机制提供一些实验依据。方法将脐静脉内皮细胞置于平行平板流动腔系统，分别施加11dyn／cm^2的均匀切应力（矩形组）和5～14dyn／cm^2的切应力梯度（梯度组）为受力组，以静态条件下培养的ECs为对照组（静止组）。Transwell方法检测切应力对ECs迁移能力的影响；半定量RT-PCR测定ECs整合素α3β1、α5β1mRNA3、6和12h的表达情况。结果①同静止组相比，切应力梯度组ECs3h的迁移（88±4 vs 23±3，P〈0．01，n=3）能力显著提高；而均匀切应力组ECs3h迁移（21±3VS23±3）同静止组相比，差异无统计学意义（P〉0．05，n=3）；②ECs受切应力梯度作用3h即可诱导ECs整合素α3β1、α5β1mRNA表达（P〈0．01，P〈0．05）；均匀切应力于6h激活ECs整合素理，亚型表达（P〈0．01），α3 、β1亚型表达延迟到12h激活（P〈0．01）。结论切应力通过上调整合素基因表达促进了ECs迁移，提示整合素信号通路参与了切应力条件下ECs迁移过程的信号转导。     

ERK1/2信号转导途径在低切应力上调人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达中的作用

血管内皮细胞位于血流和血管壁之间,除受化学因素的调节外还受力学因素的影响。切应力可通过刺激相应的力学感受系统来调节内皮细胞某些基因的表达,其中包括诱导内皮细胞表达IL- 8。为了阐明MAPK信号途径中的ERK1/ 2信号通路是否参与调控低切应力上调人脐静脉内皮细胞IL- 8基因表达,采用Western blot分析了低切应力(4.2 0 dyne/ cm2 )处理不同时间内皮细胞ERK1/ 2的磷酸化水平及TPK抑制剂Genistein,MEK抑制剂PD980 5 9对其磷酸化的影响;采用定量RT- PCR检测内皮细胞经低切应力刺激或给予阻断剂后再行切应力刺激等处理后IL- 8基因的表达。结果显示:(1)低切应力处理可引起内皮细胞ERK1/ 2蛋白磷酸化水平上调,其磷酸化水平与切应力作用时间有关,具有快速、双向性的特点(在刺激10 min时达到高峰,2 h左右降至未刺激水平) ,阻断剂Genistein和PD980 5 9处理后,ERK1/ 2磷酸化水平与低切应力刺激10 min比较明显降低;(2 )阻断剂Genistein,PD980 5 9可显著抑制低切应力所致的内皮细胞IL- 8m RNA上调。结果表明低切应力可通过ERK1/ 2信号途径上调人脐静脉内皮细胞IL- 8基因的表达。