同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死

背景:骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用,但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚。目的:观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响。设计:大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察;细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验。单位:华中科技大学协和医院心内科,同济医学院心血管病研究所。材料:健康雄性Wistar大鼠94只。表达载体PAdTrack/VEGF165。方法:实验于2004-06/2005-06在同济医学院心血管病研究所实验室完成。①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞,以5-溴-2’-脱氧尿苷标记细胞。②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack/VEGF165。③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后,随机将其分为4组,每组均为12只,干细胞 质粒组、干细胞组、质粒组、对照组,分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和/或VEGF165转染、DMEM注射。④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查。主要观察指标:①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查。②血管计数。③超声心动图检查。结果:48只大鼠进入结果分析。①干细胞 质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2’-脱氧尿苷标记的移植细胞,其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞 质粒组>质粒组>干细胞组>对照组(P均<0.01)。③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善,射血分数值增加幅度为干细胞 质粒组>干细胞组>质粒组>对照组(P均<0.01)。结论:同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能。     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合VEGF基因转染治疗心肌梗死的实验研究

目的：探讨同种异体骨髓间质千细胞（BMSCs）移植联合血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响：方法：体外分离、纯化、培养大鼠BMSCs，以BrdU标记细胞；制备、抽提、纯化质粒PAdTrack／VEGF165。结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后，随机将其分为4组（n=12），进行心肌内BMSCs移植和／或VEGF165转染，组Ⅰ：BMSCs移植＋VEGF165转染；组Ⅱ：BMSCs移值；组Ⅲ：VEGF165转染；组Ⅳ：DMEM注射作为对照组。4周后行免疫组化和超声心动图检查：结果：组Ⅰ和组Ⅱ梗死及缺血心肌处可见大量BrdU标记的移植细胞，其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为组Ⅰ〉组Ⅲ〉组Ⅱ〉组Ⅳ（P均〈0．01）。细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善，EF值增加幅度（△EF）组Ⅰ〉组Ⅱ〉组Ⅲ〉组Ⅳ（P均〈0．01）：结论：同种异体骨髓间质干细胞移植联合VEGF基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能，有利于心肌梗死后的康复。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验

目的：以基因转染为平台，利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞，使其可以在作为种子细胞的同时。作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导人缺血组织，从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础。 方法：实验于2004—07／2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成。①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞。②试验组用构建好的PcDNA3．1-VEGF进行基因转染，阳性对照组用PcDNA3．1空质粒进行转染，阴性对照组只加入培养液。③收集各组第1，3，5，7，9，11天的上清液，用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度；提取阳性克隆的细胞蛋白；进行Western blot分析；用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质于细胞增殖的影响。 结果：①免疫组织化学示所培养细胞CD106^＋，CD34^-。②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天，上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高，第5天时达到高峰，以后逐渐降低，10d后趋于稳定，但其浓度仍高于对照组。③Westem blot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组。④四甲基偶氯唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖。 结论：血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞，血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖，从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来。     

血管生长因子基因裸质粒DNA转染自体外周血干细胞联合移植治疗下肢缺血性疾病

目的：通过血管生长因子（VEGF）基因转染和外周血干细胞移植技术的联合应用,研究血管内皮主细胞（EPC）与血管生长因子的关系和作用机制及协同转染移植方法,探索一种安全、有效及适用范围广泛的治疗肢体缺血性疾病的方法。方法：选用18只新西兰雄性大白兔,制成动物下肢缺血模型。随机分为VEGF基因裸质粒DNA转染自体外周血干细胞（PBSC）组（A组）、自体外周血干细胞组（B组）和VEGF基因裸质粒DNA转染组（C组）。观察术后缺血肢体肌肉血管再生及缺血表现。结果：VEGF基因裸质粒DNA转染自体外周血干细胞组术后无肢体坏死,各项血管再生指标明显好于单独自体外周血干细胞移植组和VEGF基因裸质粒DNA转染组。结论：VEGF基因裸质粒DNA转染和自体外周血干细胞联合应用具有明显的协同作用,是值得进一步研究的新方法。     

血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验

目的:以基因转染为平台,利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞,使其可以在作为种子细胞的同时,作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导入缺血组织,从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础。方法:实验于2004-07/2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成。①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞。②试验组用构建好的PcDNA3.1-VEGF进行基因转染,阳性对照组用PcDNA3.1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养液。③收集各组第1,3,5,7,9,11天的上清液,用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度;提取阳性克隆的细胞蛋白;进行Westernblot分析;用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质干细胞增殖的影响。结果:①免疫组织化学示所培养细胞CD106 ,CD34-。②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天,上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高,第5天时达到高峰,以后逐渐降低,10d后趋于稳定,但其浓度仍高于对照组。③Westernblot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组。④四甲基偶氮唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖。结论:血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞,血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖,从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

转染血管内皮细胞生长因子基因骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死区血管新生的影响

背景:骨髓间充质干细胞作为基因载体,有利于外源基因保持良好的遗传稳定性,如能将血管内皮细胞生长因子基因转入间充质干细胞内移植到心肌梗死区,可望获得基因和细胞治疗相互协同促进的作用.目的:观察转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死区血管新生及血管内皮细胞生长因子基因的体内表达.设计、时间及地点:实验于2004/2007年在湖南省儿童医院儿科研究所,中南大学湘雅二医院中心实验室完成的随机对照实验.材料:实验动物为雄性清洁级Wistar近交系大鼠.以冠脉结扎法制备人鼠心肌梗死模型.方法:以密度梯度离心与贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞.当问充质干细胞生长汇合率为80%～90%时以脂转法转染pcDNA3.1-hVEGF165质粒.心肌梗死模型大鼠随机分4组进行干预:联合组于心肌梗死区移植转染血管内皮细胞生长因子基因的间充质干细胞,细胞组移植间充质干细胞、基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液.主要观察指标:移植4周后,各组大鼠心肌梗死区毛细血管密度,血管内皮细胞生长因子基因表达.结果:火鼠心肌梗死区毛细血管密度以联合组和基因组最高,高于细胞组(P=0.001,0.029),细胞组高于对照组(P=0.028).RT-PCR显示血管内皮细胞生长因子基因体内的表达从高到低依次为联合组、基因组、细胞组和对照组.结论:①作为血管内皮细胞生长因子基因的载体,骨髓间充质干细胞有利于其的稳定表达.②转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植有利于大鼠心肌梗死区的血管新生,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗.     

血管内皮生长因子对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响

背景：人工骨材料在大块骨缺损中常常无法发挥成骨作用,研究表明如果存在血供不足,骨缺损难以愈合。目的：了解血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）质粒转染细胞对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2004-08/2007-06在德国海德堡大学附属骨科医院实验室完成。材料：应用6～9月龄雌性新西兰白兔24只制备桡骨骨缺损模型,并随机分为4组;自兔的骨髓分离培养骨髓基质干细胞,传代培养扩增;通过EndoFree Plasmid Giga试剂盒扩增pVEGF165和pCR3.1的质粒。方法：将pVEGF165或pCR3.1质粒转染骨髓基质干细胞,将含有VEGF基因的质粒和VEGF基因重组的骨髓基质干细胞分别载入珊瑚人工骨材料,然后植入2组模型兔桡骨干中段15mm的骨缺损内,另外2组植入载空白质粒或空白质粒转染的骨髓基质干细胞的珊瑚人工骨材料。主要观察指标：实验动物桡骨骨缺损内人工骨材料吸收速度,血管数目以及新形成的骨量。结果：VEGF重组的骨髓基质干细胞分泌足量VEGF超过1周;血管计数发现VEGF质粒和骨髓基质干细胞能促进血管生成,但体外转染VEGF的细胞疗效更显著;VEGF质粒或其转染的骨髓基质干细胞对珊瑚人工骨材料的吸收具有促进作用。结论：VEGF基因重组的细胞能够持续表达高于正常水平的VEGF,并且能够在一定程度上促进人工骨材料的吸收。