表皮干细胞的生物学特性及应用*★

背景：尽早去除创面坏死组织、重建皮肤结构和功能，是大面积深度烧伤治疗的关键和最终目标。表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞，拥有无可置疑的潜能。 目的：总结表皮干细胞的生物学特性及应用现状。 方法：应用计算机检索2000-01/2010-10 PubMed数据库相关文章，检索词“epidermal stem cells，basic study”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2005-01/2010-10万方数据库相关文章，检索词为“表皮干细胞”，并限定文章语言种类为中文。共检索到文献271篇，最终纳入符合标准的文献38篇。 结果与结论：表皮干细胞是具有多向分化潜能、自我更新能力和高度增殖能力的细胞，具有慢周期性和对基底膜的黏附能力，其增殖分化受到壁龛及Wnt信号通路、MAPK、c-Myc、Notch信号传导通路、细胞因子等的调控。目前尚无公认的特异性标志物，可用于创面修复、基因治疗、组织工程领域。随着表皮干细胞研究的深入，将为皮肤基础研究、创面功能修复和皮肤遗传病的治疗提供新途径。     

表皮干细胞向皮肤附件诱导分化的研究近况

摘要：皮肤组织工程技术为烧伤创面的修复提供了新的方法,但现有各类组织工程皮肤也面临着共同的难题,突出表现在：没有完整的皮肤功能,尤其是缺乏毛囊、皮脂腺和汗腺等,难以达到完全意义上的“功能愈合”。表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞, 与创面修复紧密相关,是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞和皮肤及其附属器发生、修复、改建的基础。表皮干细胞具有无限增殖潜能及多向分化潜能,通过整合素-丝裂原激活蛋白激酶通路、Wnt/β-连环素-Lef/ Tcf信号通路、神经肽等途径诱导分化形成毛囊、皮脂腺、汗腺及表皮等组织。由于表皮干细胞向皮肤附件诱导分化研究尚存在许多问题,目前大部分是关于表皮干细胞向皮肤附件诱导分化的动物实验研究,而其广泛的临床应用研究有待进一步发展。     

干细胞在皮肤组织工程中的应用

目前还没有一种理想的组织工程皮肤能满足临床严重皮肤缺损患者的需求,其重要原因之一是无合适的种子细胞来源。干细胞在皮肤组织工程中的应用已取得了很大进展,但仍存在一些问题需要解决。基于此,文章重点介绍了胚胎干细胞、表皮干细胞和间充质干细胞等有代表性的干细胞的分离、培养以及在皮肤组织工程中的应用现状,并提出了存在的问题和下一步的研究方向,以期研制出更理想的组织工程皮肤替代物。     

表皮干细胞特性及其应用*

背景：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,不仅是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞,而且与创面修复紧密相关,是皮肤及其附属器发生、修复的基础。 目的：对近年来表皮干细胞的特性及临床应用研究现状做一综述。 方法：应用计算机以Epidermal stem cell,Basic study,Gene therapy为检索词,检索PubMed数据库(2009/06-08);以表皮干细胞、基础研究、基因治疗为检索词,检索CNKI数据库(2009/06-08)。 结果与结论：计算机初检得到532篇文献,中文283篇,英文249篇。阅读标题和摘要进行初筛,排除因研究目的与此文无关的127篇,内容重复性的研究158篇,Meta分析25篇,共保留31篇文献进行综述。表皮干细胞具有体内慢周期性、自我更新能力、对皮肤基底膜的黏附等典型特征,在组织结构中位置相对固定,位于表皮内血供丰富的基底层及毛囊隆突部。表皮干细胞的增殖分化受到外在因素和内在因素的影响,前者指干细胞所处的微环境,即干细胞“壁龛”,后者则包括整合素-丝裂原激活蛋白激酶通路、Wnt信号通路、c-Myc原癌基因、Notch信号传导通路。目前常用的表皮干细胞标记物包括整合素、角蛋白以及p63,p75、表皮细胞表面转铁蛋白受体CD71等。在临床应用方面,表皮干细胞可用于组织工程与创伤修复、基因治疗及表皮肿瘤等领域。     

羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合

背景：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,具有强大增殖及多向分化潜能,与创面修复紧密相关。近期研究表明糖尿病皮肤创面愈合过程中表皮干细胞数量减少、活性降低是导致其创面难愈的重要原因。 目的：观察表皮干细胞在糖尿病大鼠创面愈合中的作用。 方法：分离培养及鉴定SD大鼠表皮干细胞,并以BrdU标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,抽签法随机分为3组：表皮干细胞组创面移植羊膜负载BrdU标记的表皮干细胞;羊膜组创面移植羊膜;空白对照组创面未给予干预。 观察创面愈合情况、计算创面愈合率,苏木精-伊红及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度平均值。 结果与结论：表皮干细胞组治疗后7d创面缩小明显,治疗后14 d创面基本愈合,创面愈合率明显高于羊膜组、空白对照组 (P < 0.01)。表皮干细胞组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见增殖细胞核抗原阳性细胞表达,但表皮干细胞组的阳性细胞积分吸光度平均值与羊膜组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。结果证实糖尿病大鼠创面愈合过程中表皮干细胞与创缘表皮移行、创面的上皮化有直接关联,可有效促进其创面愈合。     

毛囊干细胞参与创伤修复及相关信号通路

皮肤的毛囊干细胞具有多分化潜能,可以分化成毛干、内髓鞘、外髓鞘、和皮肤表皮角质细胞以及皮脂腺,毛囊干细胞作为皮肤中储存的主要干细胞在维持毛囊周期和表皮创伤修复中都发挥重要作用。毛囊细胞参与创伤后表皮修复的过程研究相对较早,但对于毛囊干细胞参与此过程的研究近些年较为深入,这些过程受不同的信号通路调节,包括Wnt、BMP、FGF、Notch、SHH等。文章综述了毛囊干细胞如何参与表皮创伤修复及相关信号转导通路调节机制的研究现状,加深毛囊干细胞在临床中构建皮肤组织工程以及在整形美容医学应用中的理解。     

表皮干细胞的研究进展

背景：随着分子生物学、细胞生物学及生物工程学的发展，表皮干细胞凭借其特有的生物学优势在基因治疗、细胞治疗中越来越受到重视。 目的：综述表皮干细胞的相关研究进展。 方法：第一作者应用计算机检索2000-01/2009-01 PubMed数据库(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)相关文章，检索词为“epidermal stem cell，marker，clinical application”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2000-01/2009-01 CNKI数据库(网址http://www.cnki.net/index.htm)相关文章，检索词为“表皮干细胞，标记物，临床应用”，并限定文章语言种类为中文。共检索到文献815篇，最终纳入21篇。 结果与结论：了解表皮干细胞的来源、分布特征、鉴定方法、增殖与分化调控的机制、临床应用现状等方面的研究进展是进一步应用表皮干细胞治疗疾病的重要前提和理论基础。表皮干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能，对维持表皮的自我更新、保持皮肤的正常结构以及对皮肤的创伤修复具有重要意义。表皮干细胞已引起越来越多研究者的关注。     

组织工程皮肤移植过程中白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达

背景：白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在异体异种皮肤移植局部免疫与排斥反应中发挥了重要作用。但在组织工程人工皮肤移植过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达情况目前尚不清楚。 目的：采用表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤并移植修复兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果和局部皮肤组织白介素10与肿瘤坏死因子α的表达变化。 方法：将体外培养的人表皮干细胞或角质细胞接种到脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤;取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面随机分为4组,表皮干细胞组、角质细胞组用含表皮干细胞或角质细胞的组织工程皮肤移植于皮肤缺损创面;脱细胞真皮组移植单纯脱细胞真皮;对照组创面空置。观察创面修复情况,局部炎症反应,创面愈合时间。各组分别于术后7d在部分创面取材观察组织形态和白细胞介素10与肿瘤坏死因子α表达。 结果与结论：含表皮干细胞的人工皮肤移植后创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较角质细胞组明显缩短。白细胞介素10在各组均有表达,其中表皮干细胞组表达最强,角质细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组最弱。肿瘤坏死因子α在各组也均有表达,其中角质细胞组表达最强,表皮干细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组较弱。说明以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用有效促进皮肤缺损创面的修复治疗,创面修复过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子的表达变化可能是其取得较好效果的主要机制之一。     

糖尿病大鼠表皮干细胞的分离培养及特性

背景：表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,在创面修复中发挥关键作用。但有关糖尿病皮肤来源的表皮干细胞体外分离培养及生物特性研究较少。 目的：探索糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,为糖尿病难愈创面的防治及机制研究提供实验依据。 方法：SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法分离培养大鼠表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色和图像分析软件鉴定K19、β1-integrin阳性表达和测定阳性细胞的积分吸光度(IA)值。 结果与结论：糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率明显低于正常对照组(P < 0.01)。表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值均低于正常对照组(P < 0.01)。结果提示,运用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法可以实现糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养;糖尿病大鼠表皮干细胞体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,这可能是导致糖尿病创面难愈合的重要因素之一。     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景：发育生物学研究表明，表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉，如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞，并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。 目的：观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况，并与角质细胞进行对照。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本，由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品，角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。 方法：将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100 mg/L，均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本，剪成3.0 mm×5.0 mm皮条片，4 ℃胰蛋白酶+EDTA联合消化8~10 h，表皮真皮分离，用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打，获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中，20 min后吸去培养液和未黏附细胞，加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10 μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液，细胞约70%~80%融合后传代扩增；将未黏附细胞接种于另一培养板中，相同条件下作为角质细胞对照培养。 主要观察指标：表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。 结果：经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形，折光性较强；1 d后细胞略伸展为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形核；3 d时出现表皮干细胞克隆；5 d时克隆数量明显增多，细胞之间紧密衔接，呈铺路石状；14 d 左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率（t=1.972，P < 0.05）。 结论：采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞，且呈明显克隆性生长，具有典型的干细胞生物学特性。     

诱导型多能干细胞在神经变性疾病中的作用

诱导型多能干细胞技术是一种通过新的体细胞重编程,将组织细胞转化为可多向分化的细胞即干细胞的技术。目前已将4种转录因子导入人体皮肤纤维母细胞,并首次成功诱导出诱导型多能干细胞。此项技术不但可以建立神经系统疾病动物模型,用于发病机制和致病基因的研究,而且可以开展移植研究,验证疗效及筛选药物。     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。     

神经干细胞来源的研究与进展

神经干细胞是近期神经生物科学领域和神经外科领域的研究热点。应用神经干细胞自我更新和多分化潜能的生物学特性，移植治疗神经系统损伤或神经系统退行性疾病，已形成一种全新概念的神经外科治疗途径。然而如何获取大量的神经干细胞用于动物实验和临床应用成为限制该技术发展的难题，文章从介绍胚胎干细胞、成体神经干细胞和间充质干细胞的获取方法入手，希望将细胞移植治疗以一种安全有效的方式引入到临床治疗方案中。     

干细胞在脑性瘫痪治疗中的应用

背景：干细胞在适当条件下可以分化为神经元细胞、星形胶质细胞与少突胶质细胞，可能从根本上改善脑性瘫痪患儿神经元缺失及神经胶质细胞变性，进而改善患儿脑功能障碍，从理论上达到根治目的。 目的：回顾性分析不同来源干细胞经不同途径治疗脑性瘫痪患儿的疗效。 方法：由第一作者检索1992/2011 PubMed数据及万方数据库有关脑性瘫痪的治疗及不同来源干细胞在治疗脑性瘫痪等方面的文献。 结果与结论：神经干细胞在动物神经功能损伤中的修复作用已有很多国内外报道，但目前其在人体的临床应用仍处于临床试验阶段。虽然胚胎、骨髓血、胎儿脐带血、脐带来源的干细胞已在部分医院应用到脑性瘫痪患儿中，并取得了初步的疗效，其具体评定标准及长期疗效仍有待进一步随访、观察。     

Emerging restorative treatments for Parkinson's disease: manipulation and inducement of dopaminergic neurons from adult stem cells

Parkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative disease, characterized by a selective loss of midbrain Dopaminergic (DA) neurons. To address this problem, various types of stem cells that have potential to differentiate into DA neurons are being investigated as cellular therapies for PD, including cells derived from embryonic or adult donor tissue, and embryonic stem cells. These cell sources, however, have raised certain questions with regard to ethical and rejection issues. Recent progress in adult stems has further proved that the cells derived from adult tissue could be expanded and differentiated into DA precursor cells in vitro, and cell therapy with adult stem cells could produce a clear improvement for PD models. Using adult stem cells for clinic application may not only overcome the ethical problem inherent in using human fetal tissue or embryonic stem cells, but also open the possibility for autologous transplantation. The patient-specific adult stem cell is therefore a potential and prospective candidate for PD treatment.     

1101/神经干细胞超顺磁性氧化铁标记及对体外诱导分化的影响

目的 研究超顺磁性氧化铁（Superparam agnetic iron oxide）体外标记人神经干细胞的效果,为将来临床上应用磁共振成像（MRI）追踪标记细胞奠定基础。 方法 取孕13周人胚胎脑组织,制备成单细胞悬液,用添加表皮生长因子（EGF,20ng/ml）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,20ng/ml）的体外培养人神经干细胞球,并做传代及诱导分化。利用Feridex标记分散成单细胞的神经干细胞,行普鲁士蓝染色检测标记阳性率,5%胎牛血清（FBS）诱导标记后的神经干细胞分化,并用免疫荧光染色检测分化细胞。 结果 培养一周即可见大量的神经干细胞球,Feridex标记神经干细胞行铁染色显示胞浆中含有铁颗粒,Feridex标记的神经干细胞阳性率达90%。标记后的神经干细胞经5% FBS诱导分化能够分化为神经元和星形胶质细胞 。 结论 Feridex 能够标记神经干细胞,标记不影响神经干细胞的生物学特性,标记后能够正常体外扩增培养和定向诱导分化,本研究为神经干细胞临床移植追踪提供了新的方法。     

The application of in vitro‐derived human neurons in neurodegenerative disease modeling

The development of safe and effective treatments for age‐associated neurodegenerative disorders is an on‐going challenge faced by the scientific field. Key to the development of such therapies is the appropriate selection of modeling systems in which to investigate disease mechanisms and to test candidate interventions. There are unique challenges in the development of representative laboratory models of neurodegenerative diseases, including the complexity of the human brain, the cumulative and variable contributions of genetic and environmental factors over the course of a lifetime, inability to culture human primary neurons, and critical central nervous system differences between small animal models and humans. While traditional rodent models have advanced our understanding of neurodegenerative disease mechanisms, key divergences such as the species‐specific genetic background can limit the application of animal models in many cases. Here we review in vitro human neuronal systems that employ stem cell and reprogramming technology and their application to a range of neurodegenerative diseases. Specifically, we compare human‐induced pluripotent stem cell‐derived neurons to directly converted, or transdifferentiated, induced neurons, as both model systems can take advantage of patient‐derived human tissue to produce neurons in culture. We present recent technical developments using these two modeling systems, as well as current limitations to these systems, with the aim of advancing investigation of neuropathogenic mechanisms using these models.     

Adult stem cell therapies for neurological disorders: Benefits beyond neuronal replacement?

The modest capacity of endogenous repair processes in the central nervous system (CNS) justifies the broad interest in the development of effective stem cell based therapies for neurodegenerative disorders and other acute or chronic lesions. Motivated by the ambitious expectation to achieve functional neuronal replacement, several studies have already evidenced a potential benefit of stem cell grafts in animal models of human disorders. Nevertheless, growing evidence suggests that the effects orchestrated by stem cells, in most experimental cases, are not necessarily associated with the generation of new neurons. This hypothesis correlates with the versatile properties of adult and embryonic stem cells. When introduced into the lesioned CNS, nondifferentiated stem cells can have a positive influence through intrinsic neuroprotective capacities related to the production of neurotrophic factors, stimulation of endogenous neurogenesis, and modulation of neuroinflammation. Stem cells are also endowed with a multipotent differentiation profile, suggesting that a positive outcome could result from the replacement of nonneuronal cell types, in particular astrocytes and oligodendrocytes. Focusing on adult stem cells, this Review aims at summarizing experimental observations supporting the concept that, in cell‐based therapies, stem cells operate not through a unidirectional mechanism (e.g., generating neurons) but rather as cellular mediators of a multitude of biological activities that could provide a favorable outcome for diverse nervous disorders. © 2008 Wiley‐Liss, Inc.