1,25-二羟维生素D3负性调控被动致敏人气道平滑肌细胞中的NF-κB信号通路

 目的：探讨1,25-二羟维生素D3［1,25-(OH)2D3］对被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)中核因子κB（NF-κB）信号通路的影响。方法：原代培养HASMCs并使之被动致敏,以1,25-(OH)2D3作为干预因素。EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性;免疫细胞化学染色技术观察NF-κB p65的核易位情况;Western blotting法检测核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表达水平;实时荧光定量PCR检测维生素D受体(VDR)、维生素D 24-羟化酶(CYP24)和IκBα mRNA的表达水平;放线菌素D处理实验检测IκBα mRNA的表达。结果：(1) 1,25-(OH)2D3显著削弱被动致敏HASMCs中NF-κB的DNA结合活性及其亚单位 p65的核易位;(2) 1,25-(OH)2D3能通过增加被动致敏HASMCs中IκBα的mRNA稳定性及减少其蛋白磷酸化水平2个途径显著上调细胞中IκBα的表达;(3) 1,25-(OH)2D3显著上调被动致敏HASMCs中VDR的mRNA表达并诱发其功能性反应。结论：1,25-(OH)2D3能通过上调被动致敏HASMCs中IκBα的表达抑制细胞NF-κB信号通路,且这一作用与VDR有关,这可能是其调控被动致敏HASMCs的重要作用机制。     

NF-κB/IκB信号通路在IL-1β诱导的肾系膜细胞环氧化酶-2表达中的作用

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)/IκB信号通路在肾小球系膜细胞环氧化酶-2(COX-2)表达中的作用。方法:放射免疫测定法检测系膜细胞培养上清中PGE₂水平;RT-PCR和Westernblot检测COX-2表达;凝胶电泳迁移率(EMSA)和Westernblot检测肾小球系膜细胞中NF-κB活化、p65亚基核转位以及IκBα和IκBβ的降解。结果:IL-1β显著上调系膜细胞PGE₂释放和COX-2表达,PDTC显著抑制IL-1β诱导的COX-2表达及PGE₂释放;IL-1β诱导系膜细胞NF-κB活化,p65核转位及胞浆内IκBα和IκBβ的降解。结论:IL-1β通过NF-κB/IκB信号转导通路诱导肾小球系膜细胞中COX-2表达。     

血管生成素4对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

 目的：观察血管生成素4（Ang-4）对脂多糖(LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：EnVision法免疫组化鉴定HUVECs。LPS诱导细胞损伤,不同剂量的Ang-4干预。显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测von Willebrand因子（vWF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）含量,real-time PCR检测Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB） p65和TNF-α mRNA含量变化。结果：免疫组化示胞浆内人Ⅷ因子相关抗原呈阳性;与正常组比,LPS组细胞增殖活力降低（P<0.01）,vWF及TNF-α分泌增多(P<0.01),且TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表达升高(P<0.01);Ang-4（100 μg/L）组可恢复细胞活力,降低vWF及TNF-α含量(P<0.01),抑制LPS所致TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA的表达(P<0.01)。结论：Ang-4可拮抗LPS诱导的HUVECs损伤,这可能与抑制TLR4-NF-κB p65-TNF-α信号通路的活化有关。     

骨髓间充质干细胞移植对心衰大鼠心肌组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的影响

 目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对心衰大鼠心肌组织中基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9和金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）的影响及机制。方法：采用异丙肾上腺素(ISO)皮下注射的方法建立大鼠的心力衰竭模型,随机分成3组,每组8只,心肌内分别注射BMSCs（BMSCs组）、BMSCs条件培养液（BMSCs-CM组）及生理盐水（NS组）。RT-PCR检测3组心肌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达,Western blotting检测心肌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白,胞浆和胞核内核因子κB（NF-κB）的p65和p50,以及总蛋白中NF-κB抑制物（I-κB）和磷酸化NF-κB抑制物（p-IκB）蛋白表达水平。结果：和NS组比较,BMSCs组和BMSCs-CM组MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达明显减弱（P<0.05）,TIMP-1 mRNA和蛋白表达明显增强（P<0.05）;而与BMSCs-CM组比较,BMSCs组MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达明显减弱（P<0.05）,TIMP-1 mRNA和蛋白表达明显增强（P<0.05）。胞核中p65和p50蛋白表达,NS组明显多于BMSCs组和BMSCs-CM组(P<0.05);而胞浆中p65和p50蛋白表达,NS组明显少于BMSCs组和BMSCs-CM组(P<0.05)。和BMSCs-CM组比较,BMSCs组胞核中p65和p50蛋白表达明显升高(P<0.05);而胞浆中p65和p50蛋白表达,BMSCs组明显少于BMSCs-CM组(P<0.05)。NS组心肌组织总蛋白中p-IκB/IκB最高,明显多于BMSCs组和BMSCs-CM组(P<0.05),BMSCs组最低(P<0.05)。结论：BMSCs及其在缺氧条件下的培养液均可通过改变NF-κB的抑制蛋白IκB的活性,从而改变心衰心肌细胞胞核中NF-κB含量,影响有关基因的转录,使得MMPs水平升高和TIMPs水平降低。     

同型半胱氨酸硫内酯损伤血管内皮细胞的机制研究

目的: 在体外培养的内皮细胞中探讨同型半胱氨酸硫内酯(HTL)致血管内皮细胞损伤作用及其机制。方法: 体外培养的人脐静脉内皮细胞,与不同浓度的HTL孵育,用ELISA检测内皮细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和可溶性细胞间黏附分子(sICAM)-1的浓度,荧光显微镜检测活性氧簇(ROS)的含量、核转录因子κB(NF-κB)的激活及IκBα蛋白表达,同时检测内皮细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量与一氧化氮(NO)水平。结果: HTL(1 mmol/L)孵育内皮细胞3 h后显著增加细胞 ROS含量,刺激NF-κB转入胞核而活化,孵育细胞24 h后明显升高细胞上清液中sICAM-1和TNF-α浓度;降低细胞活力和NO的水平,增加LDH的漏出量。抗氧化剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂Apocynin和NF-κB抑制剂PDTC可显著抑制HTL所致ROS含量的增加以及NF-κB激活,降低HTL刺激的培养液中sICAM-1和TNF-α的浓度,增加培养液中NO水平。结论: HTL诱导的血管内皮细胞功能损伤的机制可能与诱导氧化应激以及NF-κB活化有关。     

温郁金二萜类化合物C对脂多糖诱导的人胃腺癌SGC7901细胞内NF-κB信号通路的影响

目的: 研究温郁金二萜类化合物C(RC)对脂多糖诱导的人胃腺癌SGC7901细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活性影响。方法: 以10 mg/L脂多糖(LPS)刺激体外培养的SGC7901细胞建立炎症模型,设正常对照组、LPS刺激组、RC预干预组(RC干预后以LPS刺激)。蛋白质印迹法检测IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表达,凝胶迁移阻滞实验检测p65与DNA结合活性。结果: 与炎症模型组比较,经温郁金二萜类化合物干预后,细胞中的IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表达均减少;入核p65蛋白与DNA结合活性减弱。结论: 温郁金二萜类化合物通过抑制核因子-κB信号通路起抗炎作用。     

CCK-8抑制LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞TNF-α转录及NF-κB活性

目的:观察硫酸化八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)TNF-α基因表达的影响,探讨核因子κB(NF-κB)是否参与这一过程,以揭示CCK-8抗炎作用的信号转导机制。方法:分离大鼠肺PIMs,经LPS、CCK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3h,用RT-PCR技术检测细胞TNF-αmRNA的表达,孵育1h,用电泳迁移率改变分析方法检测NF-κB活性,孵育30min,用Westernblot技术检测胞浆IκBα蛋白表达情况。结果:CCK-8(10^-8-10^-6mol·L^-1)明显降低了LPS诱导的TNF-αmRNA表达及NF-κB活性,增加了胞浆中IκBα蛋白水平,呈剂量依赖性,并可被丙谷胺所拮抗。结论:对LPS激活的肺PIMs,CCK-8通过抑制NF-κB活性而抑制其TNF-αmRNA表达,该作用由CCK受体介导,并与CCK-8减少IκBα蛋白降解有关,此为CCK-8抗炎作用的机制之一。     

蛋白酶体抑制剂MG132 对大鼠胶原诱导性关节炎的干预机制

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠胶原诱导性关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）的干预效果及作用机制。方法：48只雌性SD大鼠被随机分为空白对照组、CIA模型组、MG132干预模型组,每组16只CIA模型组和MG132干预模型组注射牛Ⅱ型胶原建立CIA模型大鼠,初次免疫后第21天,干预组大鼠以1 mg/kg的剂量每天1次,连续14天皮下注射MG132。建模起每周观察大鼠关节肿胀程度,计算关节炎指数（Arthritis index,AI）,第42天后称重并处死大鼠;HE染色观察关节滑膜组织的病理改变;荧光底物测定法检测滑膜组织20S蛋白酶体的活性;蛋白质印迹法（Western blot）检测大鼠关节滑膜组织NF-κB/p65、IκBα蛋白的表达情况。结果：与CIA模型组比较,MG132干预模型组大鼠关节炎指数在注射MG132后一周明显降低（P<0.05）,关节滑膜组织未见明显增生,只伴有少量炎性细胞浸润。与空白对照组大鼠比较,CIA模型组大鼠关节滑膜组织20S蛋白酶体活性增高;与CIA模型组大鼠比较,MG132皮下注射干预后关节滑膜组织20S蛋白酶体活性降低（P<0.05）。与空白对照组比较,CIA模型组大鼠关节滑膜组织高表达NF-κB/p65蛋白,其中胞核NF-κB/p65表达增高更为明显（P<0.01）,注射蛋白酶体抑制剂MG132干预后,其滑膜组织胞浆及胞核NF-κB/p65蛋白表达均显著减少（P<0.01）。与空白对照组比较,CIA模型组大鼠关节滑膜低表达IκBα蛋白（P<0.01）,注射MG132干预后关节滑膜IκBα蛋白表达显著增多（P<0.01）。结论：大鼠CIA体内实验显示,蛋白酶体抑制剂MG132经皮下注射可明显改善大鼠关节炎症状,其作用机制可能与MG132降低大鼠CIA关节滑膜组织20S蛋白酶体活性,减少其底物蛋白IκBα的表达,从而抑制NF-κB活性有关。     

NF-κB参与脂多糖致永生化小鼠脑血管内皮细胞通透性增高的调控

目的: 探讨脂多糖(LPS)对永生化小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3通透性的影响及可能的机制。方法: 实验分3组:bEnd.3细胞组、bEnd.3/vector细胞组和bEnd.3/muIκBα细胞组,后2组中分别转染空载pcDNA3.1hygro质粒和IκBα显性负性突变体DNMu-IκBα质粒。利用报告基因法、跨内皮细胞电阻抗(TEER)法、直接荧光染色法和免疫印迹(Western blotting)法分别检测LPS对细胞的NF-κB活性、细胞通透性、骨架蛋白F-actin分布、紧密连接蛋白(ZO-1和claudin-5)表达以及肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化水平的影响。结果: bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞中,LPS作用0.5 h可引起NF-κB活化(P<0.05);3 h时细胞TEER开始下降(P<0.05),并伴随细胞F-actin重构,ZO-1表达下调;12 h时,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的破坏程度均达到最高。LPS对bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞早期损害伴有MLC磷酸化增加。而bEnd.3/muIκBα组细胞的NF-κB活性被明显抑制;相应时点,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的损害作用也被减轻。同时LPS引起细胞MLC磷酸化增加的作用被明显抑制。结论: LPS通过破坏紧密连接增加脑微血管内皮细胞的通透性,该过程受NF-κB调控。     

肌肽对脂多糖诱导脑微血管内皮细胞凋亡的保护作用及机制探讨

目的　探讨肌肽对脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）引起脑微血管内皮细胞（HBMEC）凋亡的保护作用及机制。 方法　用倒置显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞内的活性氧（ROS）含量及细胞凋亡情况;Western blot法检测NF-κB P65、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白表达。 结果　与对照组相比,LPS组细胞存活率略降低（P>0.05）,早期凋亡率明显增加,同时ROS含量、核内NF-κB P65及胞浆IL-1β和TNF-α的含量均显著增加（P<0.05）。与LPS组相比,LPS+肌肽组（10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L）凋亡率有明显降低,ROS含量、核内NF-κB P65蛋白量及胞浆IL-1β和TNF-α的含量均不同程度显著降低（P<0.05）。 结论　肌肽可能通过抑制LPS诱导ROS释放,避免NF-κB P65过度激活,进而减少IL-1β和TNF-α分泌,对脑微血管内皮细胞发挥保护作用。     

抑制HMGB1表达促进血管瘤内皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对血管瘤内皮细胞(HemECs)活力和凋亡的影响及机制。方法:分离培养人HemECs,将设计并合成的HMGB1小干扰RNA(HMGB1-siRNA)转染HemECs。CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量;Western blot检测HMGB1、NF-κB p65、p-IκBα、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和survivin的蛋白表达。结果:与空白对照组比较,转染HMGB1-siRNA的HemECs中HMGB1的蛋白表达显著降低(P0.05)。与NC组比较,转染HMGB1-siRNA的HemECs活力显著降低,凋亡率显著升高,ROS含量显著升高,NF-κB p65、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低(P0.05);且与si-HMGB1组比较,HemECs中加入NF-κB信号通路抑制剂PDTC后,细胞活力抑制、凋亡率和ROS诱导及NF-κB p65、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表达下调更明显(P0.05)。结论:抑制HMGB1表达可降低人HemECs活力和诱导凋亡,机制可能是通过提高ROS含量及下调NF-κB信号通路。     

病毒性心肌炎小鼠心肌中MMP-2和NF-κB的表达

目的:初步探讨基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65在柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的小鼠病毒性心肌炎心肌中的表达。方法:6周龄近交系雄性BALB/c小鼠随机分为对照组和病毒性心肌炎组,分别给予0.1 m L PBS和10-5.69TCID50/m L CVB3注射,第4天和第10天各随机取8只小鼠处死并取血和心脏标本。Reed-Muench法测定接种病毒滴度;苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后光镜观察心肌组织病理学改变;应用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测MMP-2和NF-κB p65在心肌组织表达的分布和含量;用Western blot法检测MMP-2、NF-κB p65和IκBα在心肌组织的表达,用ELISA检测血清TNF-α含量的变化。结果:与对照组相比,免疫组化和Western blot实验结果提示病毒性心肌炎小鼠心肌中MMP-2和NF-κB p65的表达显著升高(P0.05);感染组IκBα的表达呈下降趋势(P0.05);ELISA结果提示血清TNF-α含量在感染组显著升高,差异有统计学显著性(P0.05)。结论:病毒性心肌炎小鼠心肌组织中TNF-α、NF-κB p65和MMP-2表达显著上调,可能通过相关机制参与疾病的发生。     

KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响

目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法:Western blot法检测KLF4在结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中的表达。将SW480细胞分为pc DNA3. 1组(转染pc DNA3. 1空质粒)、pc DNA3. 1-KLF4组(转染构建的pc DNA3. 1-KLF4过表达质粒)和pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组(转染pc DNA3. 1-KLF4 48 h后用1 mg/L顺铂处理细胞48 h),Western blot检测KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)的蛋白水平; CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率; DCFH-DA探针检测活性氧簇(ROS)含量。结果:KLF4在结直肠癌细胞中的表达均显著低于在人结肠黏膜上皮NCM460细胞的表达(P 0. 05)。与pc DNA3. 1组相比,pc DNA3. 1-KLF4组的KLF4蛋白表达显著增高(P 0. 05),细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著增高;而pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著低于pc DNA3. 1-KLF4组,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著高于pc DNA3. 1-KLF4组(P 0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低肿瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,增强顺铂化疗敏感性,其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号关键分子IκBα的磷酸化水平有关。     

烧伤血清对单核细胞抑制性κB降解和核因子-κB活化的影响

目的:了解烧伤血清对单核细胞抑制性κB(IκBα)降解、核因子-κB(NF-κB)活化的影响,进一步探讨烧伤血清诱导单核细胞活化分泌细胞因子的机理。方法:采用体外培养的人外周血单核细胞(PBMC),分别用正常人血清(对照组)、烧伤患者血清、烧伤患者血清+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)刺激单核细胞,采用Western印迹法检测血清刺激30、60、90、120min后单核细胞IκBα蛋白降解情况,电泳迁移率分析检测血清刺激30、60、120、240min后NF-κB活性的变化。结果:烧伤血清刺激单核细胞后30min,IκBα发生明显降解,刺激60min达高峰,2h后表达逐渐升高。而烧伤血清刺激单核细胞后30min,NF-κB活性迅速升高,30-60min达高峰,2h后接近基础状态。PDTC能有效抑制烧伤血清作用条件下单核细胞IκBα降解、NF-κB活化。结论:烧伤血清可诱导单核细胞IκBα降解,活化NF-κB,从而在机体烧伤后单核细胞分泌细胞因子过程中起重要作用。     

核转录因子κB信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用

背景：NF-κB信号通路在细胞生长分化、炎症反应、肿瘤生长等过程中发挥重要的调节作用,也参与成肌细胞分化的调控。 目的：分析NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化中的作用及其作用机制。 方法：成功构建大鼠C2C12成肌细胞体外培养-力学刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统,以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度对细胞进行拉伸培养2,6,12,24 h。 结果与结论：①C2C12成肌细胞在周期性机械拉伸力作用下,NF-κB信号通路被激活。当细胞受到应力刺激6 h后,胞核NF-κB p65亚基蛋白表达水平开始增强,24 h内NF-κB p65亚基蛋白表达水平达到峰值。加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。②IκBα蛋白表达水平在加力6 h后表达显著下降,24 h内IκBα蛋白表达水平减弱达到最低。加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。③周期性张应力促进C2C12成肌细胞分化过程中Myogenin的表达,加入NF-κB信号通路特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸 (20 μmol/L) 后再加力,Myogenin的表达明显降低。以上结果提示：①NF-κB信号通路可能参与应力介导的C2C12成肌细胞分化的调控过程。②当细胞受到应力刺激时,胞质IκBα发生磷酸化并降解。③NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用,但不是这一调控过程的惟一通路。     

脂氧素A4对肝细胞生长因子诱导HepG2肝癌细胞血管生成相关细胞因子表达的影响

目的: 探讨脂氧素A₄(LXA₄)对肝细胞生长因子(HGF)诱导的HepG2肝癌细胞血管生成相关细胞因子表达的影响。方法: 体外培养HepG2肝癌细胞,实验分为空白组、HGF处理组、HGF+LXA₄处理组、HGF+脂氧素受体激动剂BML-111处理组。RT-PCR检测脂氧素受体(ALX)表达情况,Western blotting检测COX-2、MMP-2、MMP-9、IκBα和NF-κB p65的表达量,ELISA检测TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β分泌水平, 荧光素酶报告质粒检测NF-κB转录活性。结果: HepG2肝癌细胞表达ALX,LXA₄和BML-111下调COX-2、 MMP-2和MMP-9,抑制TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β分泌,并且干扰NF-κB转位及其转录活性。结论: 脂氧素抑制HGF诱导HepG2肝癌细胞表达血管生成相关细胞因子,包括VEGF、COX-2、TNF-α、IL-1β、TGF-β、MMP-2及MMP-9,此效应可能通过干扰NF-κB活化实现。