水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定

实验采用6种发根农杆菌R1601,R15834,R1000,A4,R1025,R1感染水飞蓟植体,诱导水飞蓟发状根及其水飞蓟宾的产生。6种发根农杆菌均能诱导水飞蓟产生发状根,A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力。实验通过侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发状根产生的条件,确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的增殖。经过PCR分子鉴定,发根农杆菌中的DNA质粒成功的整合到转化根的基因组中。使用液相色谱测定了水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2.5倍。实验所建立的水飞蓟发状根培养系统,为研究水飞蓟发状根大量培养生产水飞蓟宾奠定了基础。     

黄花败酱发状根培养体系的建立及其抑菌作用研究

目的:初步建立黄花败酱发状根培养体系,并考察其抑菌效果。方法:采用发根农杆菌1601、15834、A4、1000等4种G-土壤杆菌诱导黄花败酱外植体产生发状根,考察不同外植体、菌株、侵染时间、预培养和共培养时间对黄花败酱毛状根诱导率的影响,并对发状根进行PCR检测;同时采用纸片扩散法测定其抑菌效果。结果:黄花败酱茎段作为外植体,预培养和共培养48 h,发根农杆菌A4侵染8 min,MS液体培养基pH为6时添加蔗糖浓度为40 g/L时转化率和增殖量最高,提取毛状根中总黄酮的含量为9.12%。应用PCR证实A4质粒上的rolB基因片段成功转入被感染的黄花败酱发状根中。结论:建立了黄花败酱毛状根培养体系,其发状根提取液对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。     

农杆菌转化后丹参植株再生

用发根农杆菌15834,LBA9402株和根癌农杆菌C58株感染丹参无菌苗,完成质粒转化后诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化后的丹参再生植物,再生植物移植到土壤中能够成活。用发根农杆菌转化后的再生植物的具有节间缩短,植株矮化、地下部毛状须根发达等特征。用根癌农杆菌转化后的再生植物生长旺盛,地上部分较原植物高大,根系发达,根产量和丹参酮含量都高于原植物。     

光照和植物生长物质对宁夏枸杞正常根和发状根离体生长的影响

目的:探索光照和植物生长物质对宁夏枸杞无菌苗正常根和发状根离体生长的影响,建立离体根的最佳培养体系。方法:以宁夏枸杞无菌苗正常根和发根农杆菌A₄诱导叶外植体再生的发状根为材料,观察根切段在光照、植物生长物质种类和含量等不同的培养条件下的生长(长长、侧根形成)情况。结果与结论:MS培养基中添加植物生长物质(IAA,IBA,NAA)能够诱导宁夏枸杞正常根切段的生长和分枝形成,而1 mg.L^-1IBA的存在最适合于正常根的长期离体培养。在无激素培养基上,光照能促进Ⅱ型发状根的长度增长和分枝侧根,却不利于Ⅰ型发状根的生长。在添加的3种外源植物生长物质(IAA,IBA,NAA)中,低含量的IAA更适合于Ⅰ型发状根的增长培养;而在促进Ⅱ型发状根的增长和侧根形成方面,1 mg.L^-1IBA的作用最强。随着植物生长物质添加含量的增加,Ⅱ型发状根的愈伤组织化程度也加大,同时也抑制了从发状根或其形成的愈伤组织上形成新的分枝侧根。     

四倍体菘蓝毛状根的培养及其抗内毒素成分分析

 目的 从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根并探讨用毛状根培养来大规模生产有用的药用植物次生代谢物的可能性。方法 利用发根农杆菌A4菌株对四倍体菘蓝进行感染,采用高效毛细管电泳法同时测定诱导出的毛状根中具有抗内毒素作用的五种有机酸［邻氨基苯甲酸、水杨酸、丁香酸、苯甲酸、3-(2-苯甲酸)-4(3H)-喹唑酮］的含量。结果 A4菌株从四倍体菘蓝诱导出毛状根,且毛状根含有原植物中具有抗内毒素作用的五种有机酸。结论 发根农杆菌能诱导四倍体植物产生毛状根,我们有可能利用毛状根培养来生产有价值的植物次生代谢物。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对红景天发状根的转化

目的:构建烟草根特异性启动子植物表达载体并转入红景天发状根中。方法:以双元表达载体pCAM-BIA1301为基础,用烟草根特异性启动子TobRB7和葡萄糖基转移酶基因UGTR分别取代双元表达载体中的CaMV35S启动子和GUS基因,从而获得了烟草根特异性启动子驱动葡萄糖基转移酶基因的表达载体,命名为pCA-Tob7:UGTR。通过根癌农杆菌介导法转化红景天发状根。结果:成功地获得了转基因阳性发状根,即表明所构建的表达载体已成功整合到了红景天发状根基因组中。结论:首次获得了根特异性启动子植物表达载体并整合到了红景天发状根基因组中,为进一步研究特异性启动子对红景天苷合成的调控作用奠定了基础。     

川黄柏毛状根的诱导及活性成分的产生

目的：诱导川黄柏毛状根的发生。方法：利用发根农杆菌ATCC15834,A4,R1600和R1000诱导川黄柏不同外植体产生毛状根。结果与结论：经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中,HPLC测定结果显示,川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱,并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。     

丹参毛状根不同培养时期有效成分的积累研究

丹参是唇形科草本植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的根及根茎,具有活血祛瘀,凉血清心,养血安神的功效,是临床常用的中药。毛状根是农杆菌中R i质粒的一段DNA嵌入植物基因组中并表达的结果,许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长出大量毛状根。由于其生长速度快,不需外源植     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。     

太子参毛状根诱导及培养体系的建立

目的利用3种不同发根农杆菌(ATCC15384,MSU440,R1601)诱导药用植物太子参的毛状根,建立太子参毛状根的培养体系。方法利用共培养方法研究了不同发根农杆菌、乙酰丁香酮(AS)浓度对毛状根诱导率的影响,同时对太子参毛状根的生长曲线进行了测定。结果不同发根农杆菌对太子参叶片转化率有显著差别,3个供试菌种中ATCC15834菌株诱导率最高;100μmol/L的AS可以提高太子参毛状根的诱导率;太子参毛状在培养约25d后,其生物量达最大值;毛状根PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol D基因已成功整合到太子参基因组中。结论建立了太子参毛状根诱导培养体系,为利用毛状根大规模生产药效成分奠定了基础。     

Ri质粒转化植物用于生产天然活性成分的研究进展(Ⅰ)

Ri质粒转化植物产生的发根生长迅速，能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，在生产植物天然活性成分方面具有广阔的应用前景。作者对Ri质粒的分类及转化植物的机制，发根农杆菌感染植物的方法及发根的产生与鉴定，发根培养物的特点等方面作了较详细的综述。     

Ri质粒转化植物用于生产天然活性成分的研究进展(Ⅰ)

Ｒｉ质粒子转化植物产生的发根生长迅速，能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，在生产植物天然活性成分方面具有广阔的应用前景，作者对Ｒｉ质粒的分类及转化植物的机制，发根农杆菌感染植物的方法及发根的产生与鉴定，发根培养物的特点等方面作了较详细的综述。     

菘蓝高效遗传转化系统的建立

目的:建立一套发根农杆菌高频转化菘蓝植物的有效方法。方法:采用ATCC15834和RI1601两种发根农杆菌并通过超声波处理对草本植物菘蓝的下胚轴、子叶、带子叶下胚轴进行遗传转化,比较了共培养与否对毛状根诱导的影响,并进行了不同抗生素浓度的抑菌效果筛选和毛状根增殖培养基的筛选。结果:浸染后的外植体在不经过共培养阶段的情况下,诱导后的外植体成活率高,毛状根发根时间早,发根率高;经超声波处理后的外植体其毛状根诱导率比未处理高一倍多;同时,筛选出抗生素浓度为400 mg/L时为毛状根生长的最佳抑菌浓度;毛状根在液体培养基中的增殖速度是固体培养基的2～3倍,是普通根的37倍。结论:利用新的方法成功建立了菘蓝的毛状根诱导体系。     

毛状根研究进展及其在博落回资源创新中的应用前景

发根农杆菌作为一种天然菌株可用于诱导多种植物产生毛状根性状。毛状根组织能够稳定高效地生产次生代谢产物,该研究领域正受到越来越多的关注。本文对发根农杆菌及毛状根的特性、遗传机制和应用进行了综述。同时结合本课题组前期研究基础,对毛状根在博落回资源创新与新药源途径开发上的应用前景进行展望。     

蒙古黄芪毛状根的高效诱导及毛状根生物量和总黄酮含量的比较分析

目的:解决蒙古黄芪毛状根诱导率低的问题,并分析毛状根的生物量和总黄酮含量,以期为蒙古黄芪毛状根的开发利用奠定基础。方法:用不同浓度的发根农杆菌R1601侵染自然生长的蒙古黄芪幼嫩的叶片、叶柄和茎段,诱导毛状根;用PCR技术鉴定毛状根,统计毛状根的诱导率;用紫外分光光度法测定蒙古黄芪毛状根中总黄酮的含量。结果:在四个不同发根农杆菌R1601浓度侵染下,三种外植体的诱导率在79.3%~94.9%之间;当发根农杆菌R1601菌液A600的值为1.5时,叶片的毛状根诱导率最高,达到94.9%;PCR鉴定表明诱导得到的毛状根为发根农杆菌R1601侵染所得;不同毛状根株系间生物量有显著差异;不同毛状根株系间总黄酮含量差异不明显,但均极显著高于对照品中的总黄酮含量。结论:建立了高效的蒙古黄芪毛状根诱导体系,揭示在利用蒙古黄芪毛状根合成药用成分时要对毛状根株系进行筛选。     

川黄柏高效遗传转化系统建立和植株再生研究

目的:建立发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。方法:利用发根农杆菌R1601转化川黄柏带子叶下胚轴,并将获得的毛状根,置于含不同生长调节物质配比的培养基上诱导产生再生植株。结果:建立的高频转化系统为选择生长10 d的川黄柏带子叶下胚轴,经过36 h的预培养,农杆菌菌液(OD600=0.6)浸染15 m in、共培养4d,浸染菌液最佳配制方法是在菌液培养阶段添加60μmol/L的乙酰丁香酮。经PCR检测证明发根农杆菌R i质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏毛状根和再生植株的基因组。结论:通过改善转化条件,发根农杆菌R1601可以高效诱导川黄柏长出毛状根,并具有进一步再生完整植株的能力。     

野葛毛状根的诱导及离体培养

目的; 野葛毛状根的诱导和无激素离体培养。 方法：用含超强毒性基因的发根农杆菌R1601与野葛离体叶片共培养。 结果：经感染的野葛叶片表面直接形成大量生长快、分枝多、负向地性的毛状根,毛状根离体培养具有抗卡那霉素特性和激素自给特征。 结论：建立了发根农杆菌诱导野葛毛状根的方法和野葛毛状根的离体培养系统。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

发根农杆菌RiT-DNA对墨旱莲的遗传转化

目的 建立墨旱莲Eclipta prostrata的毛状根离体培养系统。方法 分别用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株感染墨旱莲的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系,测定了毛状根的生长细线;利用高压纸电泳法对毛状根进行-DNA转化的检测。结果 首次利用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株成功地从墨旱莲中诱志出毛状根;经高压纸电泳检测,墨旱莲毛状根中含有甘露碱,表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根中。结论 墨旱莲毛状根离体培养的建立为进一步进行药物活性成分的工业化生产奠定了基础。     

圆叶牵牛毛状根的诱导及培养

目的：利用发根农杆菌,R1601,1000,1025,15834诱导约用植物圆叶牵牛产生毛状根。方法：采用共培养方法,通过对外植体、菌种、浸染时间、预培养、共培养、外源激素等因素对转化率的影响。结果：利川发根农杆菌1601,预培养60h的叶片、叶柄为转化材料,感染6～8min,加入1mg·L^-1 NAA转化率最高。结论：圆叶牵牛毛状根的诱导成功,为其遗传转化提供了依据。