鼠疫耶尔森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保护效果评价

目的 探索小肽基因34(sORF34)缺失对鼠疫耶尔森菌毒力影响,并评价sORF34缺失株免疫保护活性。方法 基于鼠疫耶尔森菌201株和鼠疫耶尔森菌EV76疫苗株利用λ-Red一步法构建小肽基因缺失株。比较鼠疫小肽基因缺失株和亲本株之间的毒力差别,并采用皮下免疫方式对小鼠进行免疫,与EV76疫苗株比较,评价体液免疫、保护率等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,小肽基因缺失株构建成功。通过皮下LD₅₀测定、生存曲线测定,表明小肽基因缺失株较亲本株毒力下降。鼠疫201ΔsORF34和EV76ΔsORF34皮下免疫后可刺激机体产生抗F1-IgG,其中鼠疫201ΔsORF34免疫组抗体滴度与EV76疫苗株免疫组差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34免疫组较EV76疫苗株免疫组抗体滴度低;鼠疫EV76ΔsORF34株可刺激机体产生低滴度抗LcrV-IgG,而EV76和201ΔsORF34株不能刺激机体产生抗LcrV-IgG。初免后42 d使用致死剂量鼠疫201株进行皮下攻毒和滴鼻攻毒,3组保护率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 小肽基因缺失株经皮下途径感染BALB/c小鼠的毒力下降,鼠疫EV76ΔsORF34株较EV76疫苗株残存毒力进一步下降,但保护率差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34株有作为鼠疫减毒活疫苗候选株的潜力。     

利用分子生物学技术对鼠疫耶尔森菌的分类鉴定

目的 对4株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)自然分离株.方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 4株菌具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(-)、脱氮(+),与鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV76)一致;其毒力因子为F1(+),VW(+),Pgm(-),PstⅠ(+),与鼠疫菌菌苗株(EV)特征完全一致;109个/ml可疑菌对实验动物小白鼠无致死能力.具有鼠疫标识基因;差异片段(DFR)分型结果,4株菌的24个DFR扩增,DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株基因组型.结论 尽管4菌株具备鼠疫菌自然分离株的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌自然分离株,而是鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV菌).     

鼠疫活菌苗的研究Ⅵ.新菌苗0614F株加强免疫后持续时间的观察

用新选育的鼠疫菌苗０６１４Ｆ株在豚鼠基础免疫２０天后再加强免疫一次。结果表明，加强免疫２０天后血清Ｆ１抗体迅速达到高峰。几何平均滴度为１１４，至４个月时尚能１００％保护豚鼠耐受强毒鼠疫菌１４１株１０亿菌体的攻击，它比生物制品规程中免疫力试验要求攻击的菌量大１０＾５倍，仍然获得较好的免疫效果。作者认为，在鼠疫动物病流行猛烈的地区，鼠疫活菌苗施行两次接种，预计可提高易感人群的抗感染能力。     

青海地区鼠疫菌株毒力特性的研究

本文对青海省喜马拉雅旱獭氨疫自然疫源地内的３８３株鼠疫菌的毒力测定结果进行了分析。有３７３株属于强毒鼠疫菌，７株中等毒力菌，３株为自然界分离的弱毒鼠疫菌。于同一地区不同流行年代、不同宿主分离的鼠疫菌毒力无明显差异，青藏高原型菌株毒力比祁连山型菌株毒力强。缺失Ｐｇｍ、ＶＷ因子的菌株大多毒力减弱，但有的也保持了较强毒力。另有１２株经过长期人工培养基传代保存的菌株毒力明显降低。     

陕西省两起鼠间鼠疫流行鼠疫菌生物学特性比较

目的通过对两起鼠间鼠疫流行鼠疫菌生物学特性进行比较,了解陕西省动物间鼠疫流行的病原特点。方法对2000～2001年、2006年动物鼠疫流行期间所分离菌株的生化、毒力、毒力因子及质粒进行比较分析。结果被鉴定菌株发酵阿胶糖,分解甘油,不发酵鼠李糖、麦芽糖,脱氮阴性。所有测试菌株含有F1和Pst1因子,2000～2001年19株鼠疫菌除1株Pgm±外,均含有4种毒力因子,2006年5株测试鼠疫菌均不含VW因子,2株不含Pgm因子。2000～2001年5株测试菌LD50在41～180个菌之间,2006年5株测试菌LD50在100～12.5亿个菌之间;2000～2001年未进行质粒检出工作,2006年鼠疫菌检出6、45、65 MD 3种质粒。结论所有鉴定菌株生化特点符合鄂尔多斯高原沙鼠鼠疫菌生化特性,引起两起鼠间鼠疫的鼠疫菌毒力因子及毒力不完全相同,2000～2001年鼠疫菌为强毒鼠疫菌,2006年鼠疫菌毒力有强弱之分,5株测试菌3株强毒菌,2株弱毒菌。     

基于地理信息系统的青海省鼠疫菌毒力研究

目的测定青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力,建立青海省鼠疫自然疫源地毒力基础数据。方法选取392株鼠疫菌进行毒力试验,用SPSS18．0计算各试验菌株的半数致死量（LD50）,运用地方病地理信息系统分析其空间构成。结果392株鼠疫菌中鼠疫强毒株有367株,占93．62％;鼠疫中等毒力株有10株,占2．55％;鼠疫低毒株有10株,占2．55％;鼠疫弱毒株有5株,占1．27％;发现青海省鼠疫自然疫源地祁连山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力强。结论青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌以鼠疫强毒株为主。     

陕西省2000～2001年分离鼠疫菌株特性及分析

目的 为了解陕西省动物鼠疫流行的病原特点。方法 对2000～2001年定边县分离于不同宿主、媒介动物的19株鼠疫菌进行了生化、毒力因子和毒力测定。结果 所有菌株生化特点一致,4种毒力因子除1株菌为Pgm±外,均齐备。对5株菌的毒力测定LD_(50)介于41～180之间。结论 分离菌株为鄂尔多斯高原生态型强毒鼠疫菌。     

宁夏盐池沙鼠疫源地鼠疫菌株毒力因子特性研究

本文对宁夏盐池沙地鼠自然疫源地内９６株鼠疫菌的毒力测定结果进行了分析，有７１株属于强毒鼠疫菌，１７株为中等毒力菌，８株为弱毒菌，从同一地区不同宿主分离的鼠疫菌毒力无明显差异。但流行末期分离的菌株毒力呈下降趋势。质粒分析，发现沙土鼠疫源地区菌株普启蒙具有４条带，分别为６，１３，４５和６５Ｍｄａｌ。９６株菌中仅一株缺失４５Ｍｄａｌ质粒，另外２株菌缺失１３Ｍｄａｌ质粒。菌株的毒力与色素沉着能力和Ｌｃｒ相     

鼠疫FI McAb致敏红细胞用于反向间接血凝试验检测鼠疫菌及其FI抗原

用鼠疫FI McAb致敏红细胞反向间接血凝试验,检测鼠疫FI抗原16ng/ml、鼠疫EV菌1.5×15~6菌体/ml、鼠疫强毒菌5×10~4～1.5×10~6菌体/ml均出现阳性反应;检测2株缺乏FI抗原的鼠疫菌、5株鼠疫菌的近缘菌,菌液浓度为10~9菌体/ml,均为阴性反应;检测感染鼠疫强毒菌病死动物脾脏浸液,小白鼠阳性率24/24,长尾黄鼠阳性占检菌阳性的50/52。本检测方法可用于鼠疫动物病的追溯诊断。     

脂质体包裹鼠疫EV活菌对实验动物的免疫增强作用及豚鼠自动保护力…

用菜籽磷脂制成脂质体包裹鼠疫ＥＶ活菌后对实验动物进行了抗体动态观察，比较了不同含量的脂质体对免疫增强作用的影响，同时还进行了豚鼠自动保护力试验。结果表明，两种浓度的脂质体－ＥＶ菌免疫的豚鼠和小鼠血清抗体滴度都比单用ＥＶ菌免疫的动物明显提高，阳性滴度持续时间延长，统计学表明二者差异非常显著，经用脂质体－ＥＶ菌免疫的动物获得完全保护，可以抵抗高达１０亿强毒鼠疫菌的攻击。     

脂质体包裹鼠疫EV活菌对实验动物的免疫增强作用及豚鼠自动保护力实验观察

用菜籽磷脂制成脂质体包裹鼠疫ＥＶ活菌后对实验动物进行了抗体动态观察，比较了不同含量的脂质体对免疫增强作用的影响，同时还进行了豚鼠自动保护力试验。结果表明，两种浓度的脂质体一ＥＶ菌免疫的豚鼠和小鼠血清抗体滴度都比单用ＥＶ菌免疫的动物明显提高，阳性滴度持续时间延长，统计学表明二者差异非常显著，经用脂质体二ＥＶ菌免疫的动物获得完全保护，可以抵抗高达１０亿强毒鼠疫菌的攻击。     

鼠疫菌Vw Pgm突变与毒力的关系

研究了鼠疫菌ＶｗＰｇｍ突变与毒力的关系。青海疫源地内青藏高原型和祁连山型鼠疫菌ＶｗＰｇｍ的突变率无明显差异。经人工培养２０～２４代后，Ｖｗ＋菌株可能为Ｖｗ－，毒力明显降低，Ｐｇｍ＋菌株除１株转为Ｐｇｍ－，１株为Ｐｇ±，其余３株仍为Ｐｇｍ＋，Ｖｗ毒力因子具有更不稳定特点。测定了同一菌株中不同Ｐｇｍ特征的毒力，Ｐｇｍ＋细胞里强毒，Ｐｇｍ－鼠疫菌经１０代小白鼠传代，均无Ｐｇｍ＋细胞回复。     

陕西省2006年鼠疫菌生物学特性及分析

目的通过对鼠疫菌株的生物学特性分析,探索陕西省动物间鼠疫疫情的流行特点。方法常规方法测定2006年动物间鼠疫疫情中所分离的5株代表性鼠疫菌株的生化、毒力、毒力因子及质粒。结果所有菌株均符合鄂尔多斯高原沙鼠鼠疫菌的生化特性;LD,。在100～12．5亿之间;4种毒力因子n和PstI均存在,3株Pgm＋,2株Pgm-;vw均缺失;检出6、45、65MD3种质粒。结论被鉴定菌株均为鄂尔多斯高原型鼠疫菌,毒力不完全,3株强毒菌,2株弱毒菌。     

河北省鼠疫耶尔森菌毒力测定

目的研究河北省鼠疫自然疫源地分离的鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)对小鼠和豚鼠的毒力。方法选取2005年分离的鼠疫菌株(200501、200502、200507、200511、200512)、1972年分离的鼠疫菌株(7220)、1994年分离的鼠疫菌株(9401).腹股沟皮下注射法接种小鼠和豚鼠,动物死亡后常规解剖取肝、脾等脏器做细菌培养,计算每株鼠疫菌对小鼠和豚鼠的半数致死量(LD_(50))及LD_(50)的95%可信区间,比较各菌毒力的强弱。结果7220株和2005年分离的5株鼠疫菌毒力强,小鼠LD_(50)介于21.72～113.59个菌;9401株毒力相对较弱,LD_(50)为1809.88个菌。7株菌对豚鼠均有较强的毒力,LD_(50)介于3.35×10~2～6.64×10~4个菌。结论7株鼠疫菌属于鄂尔多斯高原型强毒鼠疫菌,对小鼠和豚鼠均有较强的毒力。     

鼠疫菌EV76对达乌尔黄鼠血气的影响

目的研究鼠疫菌EV76对达乌尔黄鼠血气各项指标的影响.方法用2亿个EV76菌株加0.25%的硫酸亚铁攻击实验动物8只;设正常对照一组8只.两组动物饲养观察2～7d后分别取动脉血进行血气测试.结果免疫组动脉血pH值极显著低于正常组(P＜0.01);Pco2显著高于正常组(P＜0.05);Po2极显著低于正常组(P＜0.01);K+显著高于正常组(P＜0.05).结论鼠疫菌EV76对生物机体血气各项指标影响显著.     

鼠疫活菌苗接种后人群血清学反应及动物自动保护力试验

以微量被动血凝方法,观测了两组人群用冻干鼠疫活菌苗(EV活菌苗)皮上划痕免疫后的抗体变化以及对豚鼠皮上接种后的保护力试验。经EV活菌苗皮上接种后,人群血清阳转率约80～90％,血凝试验抗体滴度持续时间不长,接种后15天抗体滴度最高,1个月后逐渐下降。但动物试验显示在免疫后的6个月内具有一定的免疫力。EV活菌苗皮上接种易被群众接受,剂量以15亿个菌可靠性大。     

鼠疫FI单克隆抗体杂交瘤株的建立

先后两次分别用鼠疫EV活菌和FI抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞与SP2/0瘤细胞混合,大容量40％PEG处理后离心法杂交,用IHA和PPA-ELISA检测McAb,建立了21株分泌抗鼠疫FI抗原的McAb的杂交瘤株,初步鉴定了其中5株。观测了1株杂交瘤分泌的McAb用于RIHA的特异性和敏感性。     

我国鼠疫耶尔森菌毒力特征研究

目的 研究我国各疫源地分离的鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)毒力特征.方法 以1943-2012年我国11块鼠疫自然疫源地不同时间、地区、宿主、媒介体内分离的894株鼠疫菌作为研究对象.将每株菌的37℃24h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液,比浊后稀释为2×101、2×102、2×103、2× 104、2×l05、2× 106、2×107、2×108、2×109个/ml,分别取0.5 ml皮下注射于小白鼠鼠鼷部,每组5只动物,分笼饲养观察14 d,动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养,以分离出鼠疫菌为特异性死亡,并计算半数致死量(LD50).结果 894株代表性菌株中,87.36％(781/894)属于强毒菌,4.36％(39/894)为中等毒力株,8.28％(74/894)为弱毒菌;对不同生态型鼠疫菌株进行毒力比较,青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的青藏高原型、祁连山型鼠疫菌绝大多数属于鼠疫强毒株,分别占94.42％(457/484)、93.10％(27/29).结论 我国各鼠疫自然疫源地鼠疫菌的毒力特征以鼠疫强毒株为主.     

宁夏鼠疫菌的毒力与毒力决定因子的测定

本文对宁夏不同地区,不同宿主分离的164株鼠疫杆菌进行了毒力和毒力因子的测定。结果表明,宁夏南部阿拉善黄鼠疫源地和东北部长爪沙鼠疫源地的试验菌株,均属强毒杆菌,而阿拉善黄鼠疫源地菌株的毒力较强,因此鼠疫杆菌F_1,PSTI毒力因子作为鼠疫杆菌的诊断是可行的,通过测定,对疫源地的鉴定,鼠疫菌的分型,毒力株和弱毒株相互关系以及流行情况都有较清楚的认识。     

河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力试验

目的 测定河北省鼠疫自然疫源地2002～2003年动物间鼠疫流行期间分离到的鼠疫菌的毒力强弱.方法 实验动物选用小白鼠.选取5株具有代表性的菌株,即:200201,200202,200204,200213和200302,注射方法采用皮下注射. 结果 经过试验,200201的毒力较强,LD50为107个菌,200213毒力较弱,LD50为31620个菌. 结论 河北省鼠疫自然疫源地病原菌毒力属于中等毒力.