新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养

目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点。方法:取孕12.5~14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×10~5个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养。培养神经球5~7 d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10%胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7 d后行免疫细胞化学鉴定。结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βIII-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞。     

缺氧对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨单纯性缺氧对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法将36只新生1d大鼠随机均分为N组(正常对照组)、Q2组(缺氧2h组)、Q5组(缺氧5h组)。将海马组织在无血清培养液(均含有碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF和白细胞抗原B27)中,分别进行原代培养、单克隆培养和传代培养,单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)和Hoechst33342免疫荧光双标染色;传代培养的细胞传三代诱导分化,诱导分化3d的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Hoechst3342免疫荧光双标染色,计数NSE阳性细胞比例,进行统计学分析。结果单克隆培养的细胞均呈Nestin阳性表达,诱导分化的细胞部分呈NSE或GFAP阳性表达。Q2组、N组、Q5组细胞原代培养克隆球直径达2μm的时间分别为7d、10d、13d。传3代后,对各组细胞进行诱导分化,Q2组细胞诱导分化为神经元的比例明显高于N组,Q5组的细胞诱导分化为神经元的比例明显低于N组。结论短时间缺氧可促进在体海马神经干细胞增殖和诱导其向神经元分化,长时间缺氧则抑制在体神经干细胞增殖和向神经元分化。     

促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖

目的检测体外培养SD大鼠胚脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的生物学特性,为NSCs研究提供适宜的细胞模型;探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对NSCs增殖的影响,为NSCs的相关研究提供实验依据。方法本研究对孕14d(E14)SD大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,以nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,微管相关蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神经胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)检测NSCs分化。取第三代(P3)NSCs向悬浮培养基中添加不同剂量的EPO,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测NSCs的增殖情况。结果分离E14dSD大鼠胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。与对照组对比,加入≥5U/mlEPO后MTT检测NSCsOD值明显增高。结论 SD大鼠胚脑皮质体外培养可得到大量增殖的神经干细胞并能分化为神经元和神经胶质细胞,EPO可促进体外NSCs的增殖。     

Nogo-p4对神经干细胞分化为双极形星形胶质细胞突起长度的影响

目的 观察Nogo-p4对大鼠脊髓来源神经干细胞（NSCs）分化形成双极形星形胶质细胞突起长度的影响。方法 取4只出生24h内的Wistar大鼠,悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的NSCs,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定NSCs。把NSCs分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和Nogo-p4,分化7d后,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体标记星形     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定

目的:研究颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定,为立体定向自体神经干细胞移植治疗脑出血、脑梗塞及颅脑损伤后遗症提供临床前基础。方法:通过改进原代培养方法,从颅脑手术患者废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞(NSCs)。收集颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织各约500 mg以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过免疫荧光检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达,传代培养5代时开始进行诱导分化。结果:培养约3～10 d后,多数患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,经Nestin免疫荧光检测均呈阳性表达。选取第6代诱导分化后的贴壁细胞分别经β-Tubulin(神经元标志物)、Sox10(少突胶质细胞标志物)与GFAP(星形胶质细胞标志物)免疫荧光检测,可见少量神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞阳性表达。取第3代与第6代细胞行免疫印迹鉴定,第3代细胞仅见Nestin与少量β-Tubulin表达,第6代细胞可见不同程度的Nestin、β-Tubulin、Sox10及GFAP等表达。结论:本研究成功从颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织中分离培养获得成人NSCs,并可向神经元及神经胶质细胞分化,使立体定向自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能。     

三七总皂苷对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的探讨不同剂量三七总皂苷(PNS)对体外培养的新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法无血清原代培养新生SD大鼠海马NSCs,利用巢蛋白(Nestin),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对培养的NSCs进行鉴定。将培养的细胞分为对照组、PBS组和PNS组,PNS组包括0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 g/L组,观察各组细胞克隆形成率、细胞增殖曲线和细胞分化比例。将培养的细胞分为对照组和0.4 g/L PNS组,利用流式细胞仪检测PNS对海马神经干细胞分化的影响。结果海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性。加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起。染色呈Tuj-1和GFAP阳性。与对照组相比,中低剂量组(0.1、0.2、0.4 g/L)对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的三七总皂苷(0.8 g/L及1.0 g/L)干预组则明显抑制了NSCs的增殖,差异有统计学意义(P0.05)。在分化条件下,三七总皂苷0.4 g/L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,差异有统计学意义(P0.05)。结论三七总皂苷能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与分化

目的　从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞 ,观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法　利用无血清培养和单细胞克隆技术 ,采用原代贴壁及传代悬浮的方法 ,培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术 ,鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果　从新生SD大鼠脑室下区分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖的能力。原代和传代细胞Nestin抗原呈阳性 ,分化后的细胞可表达NSE、GFAP、GC特异性抗原。结论　本法从新生SD大鼠脑室下区分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,属于中枢神经系统的干细胞     

嗅鞘细胞对神经干细胞增殖与分化的影响

观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响。取孕14d的SD胚鼠嗅球和腹侧中脑组织,分为OECs+NSCs共培养组和NSCs单独培养组进行培养。用p75免疫组化法,p75、BrdU/nestin、GFAP、NF(神经原纤维)和p75/nestin免疫荧光法分别鉴定OECs和NSCs并观察其增殖与分化。在培养7d时,绝大多数OECs呈梭形且发出2~3个突起,少量呈扁平椭圆形,两者均呈p75阳性。在7d时,单独培养的NSCs表现为典型的神经球悬浮生长,呈BrdU/nestin阳性;14d后偶见神经球贴壁分化,球中的少数细胞呈绿色荧光标记的NF阳性,大部分呈GFAP阳性。在5d时,OECs+NSCs共培养组形成神经球;10d时球体积不断增大,球心透亮度良好;12d后神经球的体积不再增大,开始贴附在OECs上生长,可见神经球向四周伸出突起并开始分化;14d时NSCs紧贴OECs生长并同OECs广泛交织在一起,可见NSCs和OECs分别呈nestin和p75阳性,NSCs中的大部分呈NF阳性,小部分为GFAP阳性。NSCs单独培养组和OECs+NSCs共培养组中NF阳性细胞率分别为47.2%和69.5%,前者明显少于后者(P<0.05)。以上研究结果提示OECs有促进NSCs增殖和诱导其分化的作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的纯化、诱导分化及鉴定

探讨胚胎神经干细胞 (Neural stem cell,NSCs)的体外纯化扩增、保存标记、诱导分化及其鉴定方法。将14 .5 d胎龄大鼠大脑额叶皮质 NSCs在无血清 DMEM/ F12 (含 2 0 ng/ ml b FGF,2 0 ng/ m l EGF及 B2 7辅助培养液 )培养 ,利用有限稀释法将悬浮生长的单个细胞所形成的克隆球挑选出来、通过亚克隆连续传代大量扩增而纯化 ,免疫组化鉴定 nestin抗原阳性 ;选取部分 NSCs冻存、复苏后 nestin抗原阳性 ;用 Brd U孵育 NSCs,被 Brd U标记的 NSCs及其血清诱导分化后仍均呈 Brd U阳性。用血清或饲养层诱导 NSCs分化为大量表达 Tubulin- (神经元特异性抗原微管蛋白 3)阳性的神经元和 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白 )阳性的神经胶质细胞。由该实验可知有限稀释单细胞克隆连续传代是分离纯化、大量扩增胚胎期大脑 NSCs的简单有效方法。饲养层细胞也能诱导 NSCs分化为神经细胞。 Brd U可标记、示踪神经系统疾病动物模型 NSCs的实验治疗。掌握 NSCs的体外纯化培养、保存标记、诱导分化及鉴定方法可为进一步研究 NSCs的生物学特性及神经系统疾病的治疗提供新方法。     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化

目的:研究正常大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化规律。方法:应用免疫荧光染色技术,检测Nestin、NeuN、MAP2、GFAP、CNPase阳性细胞在大鼠胚胎期及生后脊髓内的分布及变化情况。结果:胚胎发育早期,脊髓中央管、灰质、白质均可检测到Nestin阳性细胞,生后Nestin阳性细胞数量逐渐减少。大鼠脊髓神经元的发生呈现明显的背腹模式,孕14d(E14)脊髓内可检测到NeuN阳性细胞,E16 NeuN阳性细胞逐渐增多,腹侧NeuN阳性细胞核体积较大,分布较稀疏,背侧神经元细胞核体积较小,分布较密集。MAP2染色结果与NeuN一致。胶质细胞的分化、成熟在生后初期进行,P4可检测到GFAP及CNPase阳性细胞,主要分布于脊髓白质内,P30在脊髓灰质内可检测到GFAP阳性细胞,细胞分支较多且短。结论:正常大鼠脊髓发育中神经干细胞的分化呈现一定规律性,向神经元方向化较早且呈明显的背腹模式,胶质细胞的分化较晚。     

巢蛋白在胚胎及新生大鼠脊髓的表达

目的　检测不同发育时期巢蛋白 (nestin)在脊髓神经干细胞的表达水平 ,探讨脊髓神经干细胞的发育规律 ,为分离、富集和增殖均质的神经干细胞以及后期的研究工作如神经干细胞定向分化及移植治疗等研究提供实验依据。方法　将Wistar大鼠按胎龄及日龄分组 ,剥离脊髓 ,制成单细胞悬液 ,经间接荧光法标记nestin抗原 ,用流式细胞仪检测和分析。结果　从E13到P7整个发育过程中都有nestin抗原的表达 ,呈升高趋势 ,其中P1期表达水平最高。出生后表达下降 ,趋近于 90d(同型对照 )表达水平。结论　巢蛋白在脊髓的表达出现于胚胎早期 ,表达水平随胎龄轻微波动 ,呈升高趋势 ,P1达到高峰 ,出生后表达下降 ,趋于成鼠的微量表达     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

HCNP与海马提取液对神经干细胞向胆碱能神经元分化的协同作用

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP)与海马提取液对海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的协同作用。方法:取孕17 d SD大鼠海马组织进行神经干细胞的培养、增殖、传代,并将其接种于2块24孔板中,培养基中均含B27、微量脑源性神经营养因子(BD-NF),将培养孔分为6组:H+T组,加入HCNP和切割穹窿海马伞侧海马提取液;H+N组,加入HCNP和正常侧海马提取液;H组,加入HCNP;T组,加入切割穹窿海马伞侧海马提取液;N组,加入正常侧海马提取液;对照组,不加HCNP和海马提取液。分化14 d后行MAP-2/ChAT免疫荧光双标检测。结果:与其它各组相比,H+T组分化的MAP-2阳性神经元最多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例最高(P<0.05);与N组相比,H+N组MAP-2阳性神经元较多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例也较高(P<0.05);与对照组相比,H组T组均可见一定数量的MAP-2阳性神经元及ChAT/MAP-2双标阳性神经元(P<0.05);N组以及对照组中MAP-2阳性神经元的数量和ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例则最低。结论:在微量BDNF存在的情况下,HCNP可促进海马神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化,切割侧海马提取液与HCNP可发挥协同作用。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分布

本研究应用BrdU注射技术及免疫荧光染色技术检测正常大鼠发育中脊髓内BrdU、PCNA、nestin阳性细胞分布情况。结果显示,胚胎12.5d(E12.5)时,BrdU阳性细胞分布于神经管全层,阳性标记率最高。随胚龄增加,大鼠脊髓内BrdU阳性细胞标记率降低。PCNA阳性细胞分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。正常成体动物脊髓内较难检测到增殖细胞。胚胎发育早期脊髓脑室带、套层、缘层均可检测到nestin阳性细胞。随大鼠脊髓发育成熟,nestin阳性细胞数量逐渐减少。本研究结果提示,脊髓源性神经干细胞的分布有时空规律性。随大鼠脊髓发育的逐渐成熟,增殖细胞减少,干细胞标记逐渐消失,因此在E12左右分离脊髓源性神经干细胞较适宜。     

无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。 目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。 方法：应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。 结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程