人AGM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经人主动脉-性腺-中肾(AGM)区及胎肝(FL)基质细胞程序诱导后,向造血干细胞(HSCs)分化的效率及其造血功能。方法: 将E14 ESCs诱导为拟胚体(EB),并在人AGM区及FL基质细胞饲养层上进一步诱导分化,培养6 d后收集细胞检测Sca-1⁺c-Kit⁺细胞含量、分析造血细胞集落形成能力及致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植经致死量 γ射线辐照的BALB/c雌鼠,观察生存率、植入状况和造血重建。结果: (1)EB来源细胞经人AGM区及FL基质细胞程序诱导后Sca-1⁺c-Kit⁺细胞含量为(21.96±2.54)%,造血集落总数为(520±52)/10⁵cells,明显优于诱导前及人AGM区基质细胞初步诱导者(P＜0.05)。(2)NOD-SCID小鼠接种经人AGM区及FL基质细胞诱导的ESCs未见畸胎瘤。(3)BALB/c雌鼠移植经人AGM区及FL基质细胞诱导的EB来源细胞后生存率77.8%,14 d外周血细胞计数明显改善,存活受鼠均检测到供体来源sry基因,而移植人AGM区基质细胞诱导的EB细胞者15 d内全部死亡。结论: 人AGM区及FL基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,有效重建体内造血功能。     

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的： 体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境，诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为造血干细胞（HSCs）。方法：将小鼠E14 ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体（EB），分别于3、6、9、12、15 d时收获EB，流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+ 细胞处于高峰期的EB细胞，在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化，并设无饲养层对照，分别于3、6、9、12 d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+ 细胞含量，并分析造血细胞集落形成能力。结果：诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9 d达峰值（27.53%± 2.84％），与未添加因子组（8.77%± 1.12％）比较差异显著(P<0.05)。将培养9 d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化，第6 d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值，分别为7.31%±1.21％、7.62%±1.52％，其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍，与无饲养层组比较显著差异（P<0.05）。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论：人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs，为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景：研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。 目的：以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。 方法：将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。 结果与结论：拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1⁺c-Kit⁺细胞占(13.12±1.30)%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。     

胚胎期造血干细胞的发生及其调控研究进展

造血干细胞(HSCs)是一种能分化为成熟血细胞的组织特异性干细胞,并且在生命体内终生都存在。而脊椎动物胚胎的主动脉造血干细胞集落在成体血液系统形成的过程中起着重要的作用。近年来人们深入地研究了胚胎期造血干细胞的发生、发展及转位归巢机制,发现其发育过程中受到转录因子Runx1及Notch等信号通路的调控,而microRNA则对造血干祖细胞的自我更新及定向分化进行转录后水平的调控。在循环建立后,造血干细胞的形成及其向红细胞的分化还受到血液动力学的调控和影响。了解造血干细胞的发生机制及调控因素对我们在体外人工诱导生成造血干细胞并应用于临床血液疾病治疗具有重要的意义。本文将对胚胎造血干细胞发生及其调控的最新研究进展进行综述。     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究

目的:探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESC)发育为造血干细胞(HSC)的方法。方法:将小鼠E14胚胎干细胞在含干细胞生长因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF)的甲基纤维素培养基中首先诱导发育为胚胎体(EB),再将EB置于均含SCF、VEGF、IL-3、IL-6及促红细胞生成素(EPO)的3种不同培养体系中定向分化为HSC,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏-姬姆萨染色的结果。结果:经两阶段诱导ESC分化为HSC,发现在甲基纤维素半固体培养体系中HSC发育缓慢,分化14d后CD34+/Sca-1+细胞数最高为(31.5±4.7)%;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育较快,细胞数量较多,分化第10dCD34+/Sca-1+细胞数即达到峰值,为(47.8±6.3)%;骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速,所产生的CD34+/Sca-1+细胞数量在3个体系中最高,为(53.6±7.2)%。经瑞氏-姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论:使用骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL-3、IL-6及EPO等细胞因子,通过两阶段诱导分化,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。     

促进胚胎干细胞来源造血干/祖细胞移植后细胞免疫功能恢复

目的:体外诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞过程中, 增加成熟T淋巴细胞的含量, 以促进其重建致死量照射小鼠的造血功能后免疫功能的早期重建。方法:胚胎干细胞在含甲基纤维素的培养基中自由分化形成胚胎体, 分化第6d添加造血生长因子, 同时添加胸腺肽, 流式细胞仪检测分化细胞中CD₃₄⁺的造血干/祖细胞和CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量, 最后将分化细胞注射入致死量照射小鼠体内, 观察60d, 以移植物抗宿主病(GVHD)发病率作为T淋巴细胞免疫功能的指标, 用PCR检测Sry反映移植细胞在宿主体内的存活。结果:分化第13d, 未加胸腺肽, CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量仅10.52%, 重建造血后无GVHD发生;添加胸腺肽, CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量升高达22.93%, 重建造血后GVHD发病率100%。结论:胚胎干细胞体外分化为造血干/祖细胞过程中, 添加胸腺肽, 能增加CD⁺₃的成熟T淋巴细胞含量, 体内重建造血后细胞免疫功能恢复较快。     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景：人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。 目的：进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。 方法：人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。 结果与结论：人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。 目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。 方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL和EB/AGM+FL+BM共4组。共培养6 d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。 结果与结论：①EB/AGM+FL组和EB/AGM+FL+BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05)。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05), 而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM+FL和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

Unexpectedly efficient homing capacity of purified murine hematopoietic stem cells

Single-cell transplantation analysis revealed that the cells that had the strongest dye efflux activity ("Tip"-SP cells) and had the phenotype CD34- c-Kit+ Sca-1+ Lin- (CD34- KSL cells) exhibited very strong proliferation and multilineage differentiation capacity. Ninety-six percent of the lethally irradiated mice that received a single "Tip"-SP CD34- KSL cell showed significant donor cell engraftment for long term. These findings support the hypothesis that "Tip"-SP CD34- KSL cells represent the most primitive hematopoietic stem cells that are capable of migrating into the primary site and surviving and/or proliferating with nearly absolute efficiency. This led us to propose high marrow-seeding efficiency as a specific characteristic of primitive HSCs, in addition to their self-renewal and multipotent capacity.     

AGM区来源的基质细胞促进造血干细胞扩增的体外实验研究

目的： 探讨主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）来源的基质细胞对造血干细胞（HSC）增殖的促进作用，为探寻HSC的体外扩增方法奠定实验基础。 方法： 分别从孕11 d BALB/c小鼠胚胎AGM区及6周龄小鼠骨髓分离、培养基质细胞，流式细胞仪等对基质细胞进行鉴定；利用小鼠胚胎干细胞（ESC）向造血细胞定向分化的模型，结合高增殖潜能集落（HPP-CFC）、原始细胞集落（BL-CFC）形成实验及流式细胞仪分析CD34+、CD34+Sca-1+细胞比例，对比研究AGM及骨髓基质细胞对ESC来源的HSC的扩增作用。 结果： 小鼠AGM和骨髓基质细胞在形态及表型上基本相似，均符合基质细胞的特征。AGM和骨髓基质细胞均可促进ESC来源的HPP-CFC的形成，但AGM基质细胞还可促进ESC来源的 BL-CFC的形成；流式细胞仪检测发现：在骨髓基质细胞支持下，CD34+细胞增加了3-4倍，但CD34+/Sca-1+却无明显增加；而在AGM基质细胞支持下CD34+、CD34+Sca-1+细胞均明显增加了4-5倍。 结论： AGM基质细胞在有效扩增小鼠HSC同时，能很好地维持HSC自我更新及多向分化的潜能。     

成人脂肪源间充质干细胞在小鼠体内具有血液血管干细胞特性

目的:观察成人脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在小鼠体内是否具有血液血管干细胞的特性。方法:将男性成人脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞经尾静脉输入6-8周龄、接受亚致死剂量射线照射的非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内(每只输入剂量为105,悬于0.4m LRPMI-1640培养基中),对照组接受同等剂量的RPMI-1640培养基中。2个月后处死小鼠。用聚合酶链式反应、流式细胞术、三色荧光法及荧光原位杂交法检测脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在实验小鼠骨髓及消化系统内的分化情况。结果:脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在单细胞水平上在NOD/SCID小鼠体内可分化为内皮细胞和造血细胞。结论:脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在体内具有血液血管干细胞的特性,这类细胞有可能作为种子细胞用以治疗血液和血管性疾病。