p21在乳腺癌化疗中对表柔比星的增敏性及其作用机制的研究

背景与目的:p21是一种重要的细胞周期负性调控因子,目前对其在乳腺癌化疗过程中的作用尚不明确.本课题旨在观察将p21基因转染乳腺癌细胞后,对表柔比星敏感性的改变,以探讨新的表柔比星耐药可能的机制.方法:构建表达载体pEGFP-p21,采用脂质体转染法转入乳腺癌细胞株MCF-7中,筛选稳定表达p21的克隆;应用实时荧光定量PCR法检测转染组细胞中p21 mRNA的表达,流式细胞术和Hoechst33342荧光染色法分析细胞周期分布和凋亡变化;应用MTT法检测p21基因转染前后MCF-7细胞对表柔比星敏感性的变化,实时荧光定量PCR法(real-time fluorogent quantitative PCR,RFQ-PCR)观察survivin mRNA水平的变化.结果:pEGFP-p21载体转染MCF-7细胞后,MCF-7细胞中p21 mRNA的表达量明显增高,是空白对照组的155倍;转染后的细胞被阻滞于G0/G1期,但实验组与空白对照组相比,凋亡率改变的差异无统计学意义(P>0.05);表柔比星与p21基因转染联合作用时,p21可促进表柔比星对MCF-7细胞的杀伤作用,且细胞的抑制随作用时间的增加而增强,同时伴有survivin mRNA表达的降低,与表柔比星单独作用相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:p21基因能增强MCF-7细胞对表柔比星的敏感性,其作用可能是通过使细胞周期发生G0/G1期阻滞及下调survivin的表达来实现的.     

稳定转染HBx基因的HepG2细胞株的建立及其对p53-p21途径的影响

目的 将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株, 并研究转染后对p53-p21途径的影响。 方法 用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx 转染入肝癌细胞HepG2中, G418筛选出稳定转染X基因的细胞株。细胞生长曲线、平板克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的恶性表型,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测p53蛋白的表达,RT-PCR检测p21基因。结果 成功筛选出pcDNA3.1-HBx稳定转染的HepG2细胞株;细胞生长实验、平板克隆形成实验显示稳定转染乙型肝炎病毒X基因的肝癌细胞恶性表型增高;流式细胞仪结果显示,转染后的细胞株凋亡率增高,G₁/G₀期细胞减少,G₂期细胞增多;Western blot 和RT-PCR分别显示,转染株p53蛋白表达增高,且下调p21基因水平。 结论 乙型肝炎病毒X蛋白可刺激肝癌细胞生长, 稳定转染X基因的细胞株可能通过p53-p21途径增加肝癌细胞的恶性表型。     

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响

背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.     

Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响

目的:探讨survivin反义RNA/HSP70双基因转染对肝癌细胞系HepG2的影响.方法:将已成功获得的双基因载体(pIRES2-ECFP-survivin反义RNA/HSP70)用脂质体介导转染肝癌细胞系HepG2,转染72小时,收集各组细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过RT-PCR、western-blot检测转染后细胞中survivin mRNA、survivin蛋白及HSP70蛋白表达的变化.结果:转染双基因载体与转染空载体的肝癌细胞系HepG2于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;转染双基因载体的HepG2细胞与转染空载体的HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高.结论:Survivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰HepG2内源survivin的表达,HSP70能上调HepG2细胞HSP70蛋白的表达.     

p53基因对人胚肺成纤维细胞周期影响的研究

背景与目的:研究野生型和179位残基突变型p53基因在HELF细胞周期调控中的作用.探讨p53基因的179位残基突变对细胞生长的影响.材料与方法:用野生型p53(pcDNA3-wtp53)和179位残基突变的突变型p53(pcDNA3-mtp53)转染HELF细胞,观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线;用流式细胞仪分析细胞周期;用RT-PCR和Western blotting方法检测p53基因转染后HELF细胞周期相关基因mRNA和蛋白的表达.结果:野生型p53表达的上调使HELF细胞周期阻滞于G1期,细胞体积减小,并下调cyclin D3、cyclin E、Cdk2和Cdk4的表达,同时上调p21的表达.而179位残基突变的突变型p53表达的上调则促进细胞周期从G1期到S期的转换,同时细胞体积增大,上调cyclin A和Cdk4的表达.结论:p53的179位残基突变对于HELF细胞cyclin A和Cdk4的表达有诱导作用,并可能借此促进细胞周期进程.     

mTOR和survivin在他莫昔芬诱导肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

目的 探讨mTOR信号分子和凋亡抑制因子survivin在他莫昔芬处理的肝癌HepG2细胞中的表达变化.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和双荧光素酶报告基因检测方法,检测HepG2细胞在他莫昔芬处理前后survivin的表达和p70S6K的活性;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 20μmol/L的他莫昔芬在诱导HepG2细胞凋亡的同时,可使survivin在HepG2细胞中的表达减少,同时下调了 p70S6K的活性.mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素和他莫昔芬联合处理HepG2细胞后,HepG2细胞增殖率较对照组下降了 64.7%,差异有统计学意义(P＜0.05),同时survivin蛋白表达明显下降,而survivin mRNA表达无明显变化.结论 他莫昔芬和雷帕霉素能够协同下调HepG2细胞中survivin的表达,他莫昔芬下调HepG2细胞中survivin的表达可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节其转录和转录后水平,进而诱导肝癌细胞凋亡.     

苯并芘对HELF细胞周期及相关基因表达的影响

背景与目的： 探讨苯并芘(benzo[a]pyrene, BaP)影响人胚肺成纤维细胞(HELF)周期的途径和作用机制。 材料与方法： 用5 μmol/L的BaP处理HELF细胞后,采用细胞计数,流式细胞仪检测BaP对细胞生长和周期的影响,用PCR和Western-blotting检测BaP对细胞周期相关基因mRNA和蛋白的影响。 结果： BaP处理HELF细胞后,显著促进细胞的生长,在处理后第8 d时细胞数目约增加50％(P<0.01),细胞体积增大,促进细胞由G1期向S期和G2/M期的转换。 mRNA和蛋白检测结果显示：BaP处理细胞后可以促进p53、cyclin D1、CDK2、CDK4和p21 mRNA及蛋白的表达(P<0.05或P<0.01),抑制cyclin E mRNA及蛋白的表达(P均<0.01),而对cyclin A和p27 mRNA及蛋白表达没有明显影响(P均>0.05)。 结论： BaP对HELF细胞周期的调控逃脱了p53-p21的关卡作用,而通过诱导cyclin D1、CDK2和CDK4的表达来加快细胞周期的进程,该途径为cyclin A和p27非依赖型。     

苦参碱诱导人肝癌细胞分化、凋亡时对 G1细胞周期调节因子的调控

目的：观察苦参碱诱导人肝癌细胞分化、凋亡时,G1细胞周期调节因子的变化,探讨苦参碱对肿瘤细胞增殖的调控。方法：0、0．3、0．8、1．5g/L苦参碱作用HepG2细胞3天,免疫组化检测p53,Rb,p21,p27,p16,cyclinD1蛋白表达：原位杂交检测p53,cyclin D1mRNA的表达。真彩色图像分析对基因表达强弱进行定量。结果用Microsoft-Excel软件统计处理。结果：用药后细胞周期负调控因子p53,Rb,p21,p27,p16表达增强;正调控因子cyclinD1表达减弱。结论：苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2分化、凋亡的机制可能与苦参碱上调了G1细胞周期负调节因子的表达,下调了G1期正调节因子cyclinD1表达有关。     

野生型p53对SMMC-7721细胞中POLD1基因的影响

目的探讨野生型p53基因表达对人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的影响。方法设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒（p53-siRNA）和表达EGFP-p53融合蛋白的p53绿色荧光真核增强表达质粒（pEGFP-p53）,通过稳定转染,将表达pEGFP-p53重组质粒、p53-siRNA转染入SMMC-7721细胞;经G418筛选,获得稳定细胞系7721-p53、7721-p53RNAi。通过RT-PCR检测转染后p53、POLD1的mRNA。结果在人肝癌细胞SMMC-7721中,野生型p53高表达组能够抑制POLD1的基因转录（P〈0.001）;而低表达组能够促进POLD1的基因转录（P〈0.001）。结论在人肝癌细胞SMMC-7721中,p53能够调控POLD1的基因转录。     

RU486对前列腺癌细胞增殖相关基因表达的影响

目的:探讨米非司酮(RU486)对人前列腺癌PC-3和LNCap细胞增殖及相关基因Cyclin E、CDK2、p21和p27表达的影响.方法:体外培养前列腺癌PC-3和LNCap细胞,用RU486处理PC-3和LNCap细胞,CCK-8检测对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测对细胞周期的影响;RT-PCR法检测细胞增殖相关基因Cyclin E、CDK2,p21和p27mRNA的表达,蛋白质印迹法检测细胞增殖相关蛋白CDK2、pCDK2的表达.结果:RU486对PC-3和LNCap细胞体外增殖均有明显的抑制作用,且呈时间-剂量依赖性;25 μmol/L RU486处理PC-3和LNCap细胞24 h后,2种细胞均被阻滞在G1/S期;不同浓度的RU486处理PC-3和LNCap细胞24 h后,随着RU486浓度的增加,Cyclin E mRNA表达下降,p21和p27 mRNA表达增加,CDK2 mRNA表达无明显变化,但pCDK2表达呈下降趋势.结论:RU486能使前列腺癌LNCap和PC-3细胞周期阻滞在G1/S期,并能通过上调p21和p27 mRNA的表达,下调Cyclin E mRNA及磷酸化的CDK2蛋白而抑制细胞增殖.     

阿霉素联合p21CIP1基因转染对人肝母细胞瘤细胞株HepG2增殖的影响

背景与目的:阿霉素类药物是治疗肝母细胞瘤的传统化疗药,但近年来其疗效不佳是困扰临床的一大问题,目前配合基因治疗提高阿霉素的疗效,是肝母细胞瘤治疗发展的新趋势。本实验研究阿霉素与p21基因转染联合对人肝母细胞瘤HepG2细胞增殖的影响。方法:实验分为空白对照组、单独加药组、pcDNA3转染对照组、p21转染组及p21转染 药物联合组。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后HepG2细胞的生长趋势,联合处理后细胞增殖抑制状况;荧光定量PCR检测转染后p21mRNA的表达情况,联合处理后survivinmRNA的水平变化。结果:转染后,p21转染组在第3d和第4d的生长速度明显慢于两对照组(P<0.01);经鉴定其有p21mRNA表达量的增高,是空白对照组的155倍(P<0.05)。以空白组为对照,在第3～5d,联合组增殖抑制率明显高于单独加药组和p21转染组(第3d:43.92%vs.32.97%、35.77%,P<0.01;第4d:59.86%vs.39.35%、40.96%,P<0.01;第5d:51.81%vs.33.91%、10.68%,P<0.01);且1～4d内随联合用药时间的延长,抑制效应增强(r=0.91,P<0.05),并在第4d时较显著(Q=1.07)。荧光定量PCR显示,联合组survivinmRNA水平显著低于p21转染组(P<0.01);与单独加药组比较,联合作用仅在48h时差异有统计学意义(P<0.01)。结论:在一定时间范围内p21可增强阿霉素对HepG2细胞的增殖抑制作用,降低胞内survivinmRNA的表达。     

Doxorubicin-induced apoptosis and chemosensitivity in hepatoma cell lines

PURPOSE: Doxorubicin (DOX) is a commonly used anticancer drug which causes DNA damage and kills cancer cells mainly by apoptosis. However, the process leading to killing of cancer cells and the molecular basis of resistance to DOX are not well understood. To evaluate the role of p53 and the cellular effects of DOX on hepatoma cell lines, we examined three hepatoma cell lines with different p53 status--Huh-7 (mutated p53), HepG2 (wild-type p53) and Hep3B (deleted p53). METHODS: The chemosensitivity of the three hepatoma cell lines was assessed using the MTT assay, and cell cycle distribution was evaluated by flow cytometry. Western blotting and immunostaining were employed to examine the protein alterations in response to DOX treatment, and a DNA fragmentation assay was performed to detect apoptosis. RESULTS: Of the three cell lines, HepG2 was found to be most resistant to DOX, followed by Hep3B, and Huh-7 was most sensitive to DOX treatment. HepG2 showed G1 arrest 24 h after drug administration and upregulation of p53 protein level in a time-dependent manner. In Hep3B cells (deleted p53), G2/M phase arrest was observed soon after drug administration, accompanied by induced apoptosis that was p53-independent. In Huh-7 cells (mutated p53), which were most sensitive to DOX, there was neither G1 nor G2 arrest, and the level of p53 mutated protein was downregulated after DOX treatment. MDM2 and p27 proteins were downregulated in all cell lines independently of p53 status. p21 was upregulated following p53 activation at low doses of DOX in HepG2 cells, but at higher doses, p21 was downregulated in Huh-7 and HepG2 cells. CONCLUSION: DOX confers different chemosensitivity on different hepatoma cell lines with different p53 status. The contrasting relationships between chemosensitivity and p53 status and expression suggest that DOX-induced apoptosis and cell death involve pathways that are independent of p53.     

辛二酰苯胺异羟肟酸对结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的:研究辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对结肠癌细胞系HCT116和SW480增殖、周期和凋亡的影响,并对其分子作用机制进行初步探讨.方法:将不同浓度SAHA分别处理结肠癌HCT116和SW480细胞后,MTT法检测SAHA对HCT116和SW480细胞增殖的影响,流式细胞仪检测HCT116和SW480细胞周期和细胞凋亡率,罗丹明(rhodamine) 123和二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测HCT116和SW480细胞线粒体跨膜电位(Aψm)和活性氧(ROS)水平,Real-time PCR和Western blotting法检测乙酰化组蛋白3(Ac-H3)、p21、CyclinD1、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白的表达水平.结果:SAHA作用于HCT116和SW480细胞48 h后,细胞增殖被抑制、细胞周期G1期比率升高、凋亡率升高(均P＜0.05),线粒体跨膜电位显著下降、细胞内ROS产生增多(均P＜0.05).与对照组比较,SAHA处理组p21和Bax mRNA增多、Cyclin D1和Bcl-2 mRNA表达量减少(均P＜0.05),相关蛋白Ac-H3、p21和Bax增多,CyclinD1和Bcl-2减少(均P＜0.05).结论:SAHA抑制结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,其机可能与调节p21、CyclinD1和Bcl-2家族基因的表达、促进组蛋白乙酰化有关.     

胃癌患者外周血Survivin水平与幽门螺杆菌感染的关系

目的 探讨胃癌患者外周血中Survivin mRNA水平与幽门螺杆菌（Hp）感染的关系。方法 应用实时荧光定量qPCR技术检测胃炎及化疗前胃癌各50例患者外周血中Survivin mRNA表达,并采用快速尿素酶试验与Giemsa 染色2种方法检测Hp感染情况。结果 胃炎患者外周血中未检测到Survivin mRNA表达;胃癌组患者Survivin表达检测率为84.0％（42/50）,外周血Survivin mRNA表达水平的中位数为0.46。Survivin表达水平与胃癌患者的年龄、性别及淋巴结转移均无关（P＞0.05）,而与TNM分期有关（P＜0.0001）。胃癌患者Hp感染率为80.0％（40/50）,显著高于胃炎患者的58.0％（29/50）,差异有统计学意义（P＜0.05）。Hp阳性的胃癌患者外周血Survivin mRNA表达水平为0.578±0.507,显著高于Hp阴性患者的0.194±0.419,差异有统计学意义（P＜0.05）。经Spearman相关分析,胃癌患者Survivin mRNA表达与Hp感染呈正相关（r=0.464, P＜0.05）。结论 Hp感染及Survivin与胃癌发生可能有关,Survivin可能参与了Hp感染性胃癌的发展。     

EGCG对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及E2F-1表达的影响

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法采用CCK-8法检测EGCG对鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖的影响;AnnexinV /PI双标记流式细胞术检测EGCG的凋亡诱导作用;实时荧光定量PCR和Western blot检测核转录因子E2F-1及其上游调控蛋白CyclinD1和 p21的表达水平。结果EGCG处理后,CNE-2Z细胞的增殖明显受到抑制,其细胞凋亡率亦显著增高,呈量效关系;随着EGCG浓度增高,E2F-1 mRNA和蛋白表达水平明显下降,其上游调控蛋白CyclinD1的表达亦明显下调,而p21的表达则明显上调。结论EGCG可明显抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,可能与其直接或间接下调核转录因子E2F-1有关,CyclinD1和p21参与其调控。