肺癌肿瘤抑制物1转染HepG2肝癌细胞及作用

目的将已构建完成的携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体转染到HepG2细胞中,同时观察其对HepG2肝癌细胞的作用。方法脂质体Lipofectamine2000介导重组载体转染到HepG2肝癌细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot法检测其表达;MaT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期。结果与对照组比较,RT．PCR方法可见转染组细胞TSLC1mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高;MTT检测发现转染组细胞生长缓慢,细胞周期检测发现转染组G0／G1期细胞显著增多,而S期及G2／M细胞明显降低。结论本研究成功建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株,并证实喃LC1能够抑制细胞生长、阻滞细胞周期。     

外源性线粒体融合素基因-2转染对肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的 研究外源性线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene，mfn2)对肝癌细胞株HepG2体外生物学行为的影响。 方法 基因重组构建并鉴定mfn2真核表达质粒pEGFPmfn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western-blot检测线粒体融合蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测mfn2对HepG2细胞增殖的影响，Annnexin-V/PI双标流式细胞术检测转染细胞凋亡的变化。结果 重组真核表达质粒pEGFPmfn2经限制性内切酶双酶切，电泳后显示约约2.3kp的mfn2片段和4.7kb的pEGFP-N2¬载体片段。RT-PCR及Western-blot显示转染组有mfn2基因mRNA及其蛋白表达。MTT实验提示转染mfn2基因后，HepG2细胞增殖受到抑制；流式细胞分析显示转染组与转染空质粒组和空白对照组相比可促进细胞凋亡。结论 成功构建了pEGFPmfn2真核表达质粒，外源性mfn2基因可抑制肝癌细胞的增殖，并可诱导肝癌细胞凋亡。     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

转染乙肝病毒基因的HepG2细胞Tooll样受体2的表达上调

目的:前期研究发现先天免疫分子TOU样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)与乙型病毒性肝炎的免疫损伤有一定的关系,现进一步观察瞬时和稳定转染乙肝病毒(HBV)基因的HepG2细胞TLR2表达的变化.方法:采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组.采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2在细胞上表达的MFI及阳性细胞率.结果:HepG2.2.15细胞上TLR2表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均P＜0.001),HepG2细胞于转染48 h后TLR2表达的MFI和阳性细胞率与空白对照组(转染HBVDNA剂量为O)相比均显著升高(均P＜0.05),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈显著正相关(均r=0.950,P＜0.001).结论:不管在瞬时和稳定转染HBV基因的HepG2细胞,都存在细胞TLR2的上调,提示HBV感染细胞后存在TLR2信号途径的激活.     

干扰素抗病毒蛋白MxA和2'''',5''''-OAS在肝胚瘤细胞株中的差异表达

目的了解α干扰素（interferom-α，IFN—α）诱导的抗病毒蛋白MxA和2′，5′-寡腺苷酸合成酶（2′-,5′-OAS）在人肝胚瘤细胞株HepG2和HBV稳定转染的HepG2．2．15细胞中的表达情况。方法将培养的HepG2和HepG2．2．15细胞用IFNα刺激6h，分离细胞总RNA，经逆转录32P标记后与尼龙膜上的探针微矩阵（macroarray法）进行分子杂交；并以此来分析HepG2和HepG2．2．15细胞IFN抗病毒基因表达谱。用免疫印迹分析IFN抗病毒蛋白；如，MxA、2′，5′-OAS等在肝胚瘤细胞中的表达。结果分析发现在HepG2和HepG2．2．15细胞仅有部分IFN诱导基因表达，多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。比较HepG2和HepG2．2．15细胞，发现两者表达IFN诱导基因有差异，即对IFN应答有差异。研究中发现，MxA蛋白在HepG2．2．15细胞中不表达，而在HepG2细胞中却能正常表达。另一种重要的IFN抗病毒蛋白2′，5′-OAS，在HepG2．2．15和HepG2细胞中均能表达；在拉米夫啶处理下，HepG2．2．15细胞甚至比HepG2细胞能更好地表达。结论IFN抗病毒蛋白MxA和2′，5′-OAS在人肝胚瘤细胞株HepG2和HBV稳定转染的HepG2．2．15细胞中表现出差异的表达模式；HBV及其抗原成分影响人肝胚瘤细胞株的IFN抗病毒基因表达。     

小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响

目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。     

人SLPI启动子调控下eGFP基因表达载体的构建与表达

目的构建SLPI基因启动子驱动下EGFP表达载体并验证该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控活性。方法通过PCR方法从人外周血基因组中扩增SLPI启动子，经序列分析后，利用peDNA3．1（＋）和pEGFP构建SLPI启动子调控下EGFP表达载体，以脂质体介导转染入人宫颈上皮癌Hela、肺腺癌A549、SPC-A1和肝细胞癌HepG2细胞中，经G418稳定筛选后，在荧光显微镜下观察该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控EGFP表达的活性。结果克隆出的SLPI启动子序列与Genebank上SLPI基因上游5’末端转录调控区的序列完全一致，稳定转染的细胞株Hela、A549、SPC—A1和HepG2中，CMV启动子控制下的EGFP基因均有表达，发出绿色荧光；而SLPI启动子词控下的EGFP基因在Hela、A549和SPC-A1中有表达，发出绿色荧光，在HepG2中则未见荧光发出。结论钓取的人SLPI启动子在非小细胞肺癌细胞中具有特异调控其下游基因表达的活性，为探索该启动子调控下的抗肺癌基因治疗提供实验基础。     

糖尿病鼠模型及其与醛糖还原酶相关研究

探讨如何建立合适的Wistar大鼠2型糖尿病模型；综述醛糖还原酶基因多态性与2型糖尿病微血管并发症的关联。     

SiRNA沉默FUT6基因对HepG2细胞侵袭和迁移能力的影响

目的：通过siRNA干扰技术研究FUT6基因沉默对HepG2细胞侵袭和迁移能力的影响。方法：靶向FUT6的siRNA转染肝癌细胞株HepG2后,通过western blot检测FUT6蛋白的表达,通过流式细胞术检测肝癌细胞表面抗原唾液酸路易斯糖（Sialyl Lewis X, sLeX）表达情况。Transwell小室方法进行细胞迁移和侵袭实验检测肝癌细胞株HepG2转移和侵袭能力的变化。结果：实验分为3组,分别命名为control（空白对照组）,mock（阴性对照scrambled-siRNA）和siRNA-FUT6（实验组）。实验组FUT6蛋白及sLeX抗原较空白对照组明显降低,实验组细胞的迁移能力及侵袭能力下降。结论：siRNA靶向沉默FUT6减少了FUT6蛋白的表达,减少了肿瘤相关抗原sLeX的表达,削弱HepG2细胞在体外的迁移和侵袭能力,FUT6可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

ITIH4基因沉默对人肝癌细胞HepG2增殖、迁移及侵袭的影响

目的:探讨沉默间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4,ITIH4)基因对人肝癌细胞系HepG2增殖、迁移及侵袭的影响。方法:将4个ITIH4基因沉默载体分别转染HepG2细胞,用2 mg/L嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株。Western印迹评价沉默效率,并选择效率最高的细胞株(si-ITIH4)用于后续实验。转染无意义序列的细胞株(si-Control)作为对照组。分别用细胞计数及CCK-8细胞计数试剂盒评价两组细胞增殖。用Transwell小室评价两组细胞的迁移及侵袭。结果:成功获得ITIH4基因沉默的HepG2细胞株si-ITIH4,与si-Control组相比,si-ITIH4组沉默效率达到86%。与si-Control组相比,si-ITIH4组细胞增殖显著降低、细胞迁移及侵袭均显著减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ITIH4基因沉默可显著抑制HepG2的增殖、迁移及侵袭,提示其可能是参与肝细胞癌发生发展的重要基因之一。     

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,免疫细胞化学法（ICC）检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925,P〈0.05）,而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性（q=0.631～0.126,P〉0.05）。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调（F=68.39,q=13.71、14.37,P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（F=20.06～47.65,q=11.186、12.601,P〈0.01）。结论构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-sur-vivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。     

靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建

背景:有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。目的:构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。方法:根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。结果与结论:构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P<0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。     

HSPC238对肝癌细胞中RB基因表达的影响

目的观察HSPC238对肝癌细胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影响。方法将PcDNA3.1-HSPC238质粒和PLL3.7-HSPC238干扰载体分别转染HepG2细胞,用实时荧光定量PCR的方法检测RB mRNA的表达量;采用Western blotting法检测pRb蛋白的表达。结果和对照组相比,转染高表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb表达量也增加;相反地,和对照组相比,转染低表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表达量也减少。以上结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论在HepG2细胞中HSPC238对RB基因的表达存在正向调控作用。     

NOR1基因对HepG2细胞白介素-8水平的影响

目的探讨NOR1基因对HepG2细胞IL-8水平的影响。方法将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞后,抽提细胞总RNA,运用RT-PCR检测IL-8mRNA的水平,用ELISA检测细胞培养上清液IL-8的表达水平。结果细胞培养上清液IL-8蛋白水平,转染NOR1基因组明显高于空白组和对照组(P<0.01);而转染NOR1基因组与转染空质粒组IL-8mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05);结论NOR1基因诱导HepG2细胞IL-8蛋白水平表达增高。     

肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM的建立及耐药机制研究

目的建立人肝癌多药耐药细胞系并研究其耐药特性及机制。方法应用人肝癌细胞株HepG2,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系HepG2/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。结果HepG2/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了89.38倍。流式细胞仪分析发现(45.5±5.1)%的HepG2/ADM细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞HepG2表达仅为(11.3±1.2)%,二者差异有显著性(P<0.01);HepG2/ADM和HepG2细胞的MRP及GSH/GST表达无明显变化(P>0.05)。RT-PCR检测发现HepG2/ADM中MDR mRNA高表达。结论HepG2/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR mRNA表达升高。     

新基因Mip1的过表达对去血清培养条件下C2C12细胞生长周期的影响

【目的】建立稳定表达新基因Mip1的细胞株,并探讨正常和应激状态下Mip1过表达对细胞生长周期的影响。【方法】脂质体转染Mip1的真核表达质粒于C2C12细胞中,G418筛选阳性克隆,Western blot鉴定高表达克隆,流式细胞术检测正常和去血清状态下Mip1转基因细胞株和空栽体转基因细胞株的生长周期分布情况。【结果】建立了稳定高表达新基因Mip1的C2C12细胞株,并发现Mip1的过表达可减轻去血清对C2C12细胞的生长抑制作用。[结论]Mip1在应激状态下可能具有促细胞生长的功能。     

hOGG1基因高表达A549细胞株的构建及其对氧化应激的影响

目的 构建人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(hOGG1)基因高表达细胞株,并初步探讨该细胞株对DNA氧化损伤与修复作用的影响.方法 提取人血液淋巴细胞总RNA,设计hOGG1特异性引物,RT-PCR扩增后构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A/hOGG1载体.经EcoRI和KpnI酶切,凝胶电泳及DNA测序证实建立成功后,稳定转染A549细胞,Western blot法检测转染阳性细胞hOGG1蛋白表达的改变.以构建的hOGG1基因高表达细胞株为研究对象,H2O2为受试物,彗星试验检测比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况.结果 成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A/hOGG1质粒并转染目的 细胞,Western blot法检测转染靶细胞中hOGG1蛋白表达比空白组和阴性对照组明显增加(P<0.05).相同H2O2浓度下,转染细胞彗星细胞率和Olive Tail Moment明显低于空白组和阴性对照组,且修复完成率高,修复时间缩短(P<0.05),提示细胞对抗DNA损伤和修复能力均显著增高P<0.05).结论 hOGG1基因的高表达可确切减轻细胞氧化损伤敏感性并提升DNA的修复能力.hOGG1基因高表达细胞株的成功构建,为基因水平的靶向治疗研究提供了一种有效手段.