近致死量照射CNE1后存活克隆生物学性状初步分析

目的 放疗后残存癌细胞重新克隆是鼻咽癌放疗复发的主要原因，本实验旨在分析照射残存癌细胞的生物学特征。方法 MTT法测定6MV-X射线照射人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1的近致死剂量，用近致死量照射获得残存癌细胞存活克隆，然后用流式细胞仪检测存活克隆与亲本细胞株的细胞周期分布，应用二维电泳和质谱技术分析两者的蛋白质表达改变。结果 用15Gy近致死量照射CNE1得到了照射存活克隆，并命名为CNEI-15GyR。CNE1-15GyR与亲本细胞株相比：G1／G0期比例增高而G2／M期比例降低；有98个蛋白质表达差异点，其中76个蛋白质斑点上调，22个蛋白质斑点下调；对其中上调的20个蛋白质斑点进行了质谱鉴定，发现细胞间叶来源的中间丝蛋白Vimentin在存活克隆CNE1—15GyR中表达增高。结论照射筛选的存活克隆CNE1—15GyR与亲本细胞株CNE1相比生物学性状发生了改变，细胞间叶来源的中间丝波形蛋白Vimentin在CNE1-15GyR克隆中表达增高，可能与G1／G0期比例增高有关。     

自噬相关蛋白EPG5调节的鼻咽癌细胞经电离辐射后自噬机制的研究

目的　研究电离辐射后鼻咽癌细胞CNE1及CNE2中自噬相关蛋白EPG5的表达情况以及EPG5的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系。方法　鼻咽癌CNE1及CNE2细胞株接受不同剂量电离辐射后，用Western Blot法检测自噬相关蛋白EPG5的表达。si RNA转染法特异性敲除epg 5基因后，Annexin V-FITC/PI法检测两株细胞凋亡情况。结果　经不同剂量电离辐射后，CNE1细胞株中EPG5的表达量与放射剂量呈正相关，CNE2细胞株中呈负相关。敲除epg 5基因后，EPG 5表达减少的同时，CNE1细胞株凋亡率明显增加，而CNE2细胞株的凋亡率明显降低。结论  鼻咽癌细胞经过电离辐射后，EPG5的表达可能与肿瘤细胞的分化程度有关，分化程度较低的细胞表达下调，分化程度较高的细胞表达上调。同时分化程度低的细胞EPG5低表达可以减少细胞凋亡，这可能是低分化鼻咽癌产生放疗抵抗的分子机制。     

X射线对人鼻咽癌CNE2及CNE2/DDP细胞自噬相关基因的影响

目的:研究放疗抵抗与自噬的关系,为使用药物调节自噬水平来提高鼻咽癌放疗敏感性提供理论基础。方法:采用流式细胞术分析CNE2及CNE2/DDP细胞照射前后的细胞周期分布;实时荧光定量PCR和免疫荧光染色检测CNE2及CNE2/DDP细胞中自噬特异性基因Beclin 1及微管相关蛋白轻链3β(MAPLC3β)的表达水平。结果:射线照射后CNE2及CNE2/DDP细胞的G2-M期增多,与放射剂量呈正相关(P<0.05),CNE2/DDP细胞的G2-M期阻滞比CNE2明显(P<0.05)。射线照射后CNE2及CNE2/DDP细胞的Beclin1及MAPLC3β的表达水平增高,与放射剂量呈正相关(P<0.05)。CNE2/DDP细胞的Beclin1及MAPLC3β表达水平均低于CNE2细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:自噬性死亡可能是放射治疗后人鼻咽癌CNE2及CNE2/DDP细胞的死亡方式之一,而CNE2/DDP细胞的放射抵抗可能与低水平的自噬有关。     

外泌体miRNAs在鼻咽癌放射抵抗中的作用

目的　探讨外泌体microRNA在鼻咽癌放疗抵抗中的作用。方法　利用射线照射获得放疗抵抗性鼻咽癌CNE2细胞（R-CNE2），比较R-CNE2和CNE2细胞外泌体 中miRNA23-a和miRNA21表达水平。将R-CNE2细胞外泌体与CNE2细胞共培养，检测其对CNE2放疗抵抗的影响。结果　R-CNE2细胞外泌体产量为（11.97±1.8）μg/106细胞，高于CNE2细胞[（2.45±0.87）μg/106细胞，t =4.25，P =0.000]。R-CNE2细胞外泌体中miRNA23-a和miRNA21表达水平高于CNE2细胞外泌体（t miRNA23-a=3.47，P =0.000；t miRNA21=4.38，P =0.007）。抑制外泌体miRNA23-a后，CNE2细胞经射线照射后活力为56.75%±10.43%；而 抑制miRNA21后，CNE2细胞经射线照射后活力为24.25%±5.67%，明显低于外泌体+射线处理组（F =3.54，P =0.000）。miRNA-21模拟物组细胞活力为60.5%±5.92%大于单纯射线处理组（17%±2.55%，F =4.24，P =0.000）；而miRNA23 - a 模拟物组与单纯射线组无明显差异（26.25%±11.32%，F =2.28，P =0.27）。结论　外泌体miRNA21可能在CNE2细胞放疗抵抗中起主要作用。     

Maspin蛋白在鼻咽癌放射敏感CNE2细胞株中的表达分析

目的探讨放射敏感鼻咽癌CNE2细胞株在放射条件下丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin蛋白的反应性变化,分析鼻咽癌放射作用的分子机制。方法采用MTT比色法检测放射线对鼻咽癌CNE2细胞株生长的影响,胎盼蓝染色法检测CNE2细胞增殖,流式细胞术检测CNE2细胞放射后的凋亡及周期改变,Western blotting分析Maspin蛋白的表达。结果鼻咽癌CNE2细胞株放射后,细胞周期重新分布,出现较多的G2/M期细胞以及较少的G0/G1期细胞;增殖受到抑制、细胞凋亡明显、Maspin蛋白表达上调,且其上调与细胞凋亡率增高呈现一致性改变,也与细胞周期分布改变相关。结论鼻咽癌CNE2细胞对放射线敏感、容易被诱发凋亡;细胞周期参与了放射诱导的CNE2放射反应调节;放射提高了CNE2细胞的Maspin蛋白表达,提示该蛋白参与了CNE2细胞的放射反应;Maspin蛋白表达提高涉及CNE2细胞周期和凋亡改变,是一个值得深入研究的鼻咽癌放射敏感相关分子。     

Beclin1调控鼻咽癌细胞放疗抵抗的体外研究

目的探讨Beclin1基因对鼻咽癌细胞放疗抵抗的影响。方法Western blotting法检测CNE2、6 10B及其放疗抵抗细胞CNE2 Rs、6 10BRs中Beclin1蛋白的表达，CNE2细胞经不同条件放射线照射后Beclin1蛋白的表达改变；通过脂质体转染Beclin1 cDNA和慢病毒介导的Beclin1 shRNA，在6 10B细胞和CNE2 Rs细胞中分别过表达及沉默Beclin1基因，平板克隆集落形成实验检测鼻咽癌细胞的放疗抵抗能力的改变；细胞免疫荧光法检测DNA双链损伤相关指标γ H2AX表达的改变。结果Beclin1蛋白在放疗抵抗细胞中表达增加，同时随着放疗时间的延长及放疗剂量的增加，Beclin1蛋白表达迅速升高，随后趋于基础水平；Beclin1过表达后6 10B细胞克隆集落形成能力增强，生存分数增加，γ H2AX焦点数量减少；相反，Beclin1沉默后，CNE2 Rs细胞克隆集落形成能力下降，生存分数下降，γ H2AX焦点数量增加。结论Beclin1能促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗性，其与放疗后DNA双链损伤修复调控可能相关。     

EGCG对鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤的放疗增敏作用以及对Survivin表达的影响

目的研究凋亡抑制基因Survivin的表达与EGCG对鼻咽癌CNE 2裸鼠移植瘤放疗增敏作用的关系。方法将低分化鼻咽癌细胞CNE 2接种于4～6周龄的雌性裸鼠皮下,待移植瘤生长至4～6?mm时,随机分为4组,分别采用NS、EGCG［50?mg/(kg·w）］、放疗（15?Gy）、EGCG给药24?h后再行放疗等方法分别处理各组裸鼠,处理前后分别测量裸鼠移植瘤的短径、体积。21?d后处死裸鼠,取出肿瘤并称重,将肿瘤组织分成两份,分别用来进行病理切片TUNEL染色以及RT PCR检测Survivin mRNR的表达。结果EGCG＋放疗对裸鼠移植瘤的生长抑制最为明显,肿瘤生长抑制率为89.3%,消退率为40.0％。与对照组EGCG组、放疗组相比,EGCG＋放疗组的凋亡指数均明显增加（P＜0.05),同时,伴有Survivin mRNR的表达显著下降（P＜0.05）。结论EGCG对鼻咽癌裸鼠移植瘤可能具有放疗增敏作用,这种作用可能与凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关。     

体外放疗合并腔内固化治疗鼻咽癌的疗效观察

目的探讨体外放射治疗合并微波固化热疗对鼻咽癌的临床治疗价值.方法采用放射治疗合并微波固化热疗对临床32例鼻咽癌患者进行治疗观察,与常规单纯放射治疗进行对比分析.治疗组体外照射36Gy后,采用微波腔内固化一次,瘤体表面温度90±5℃.休息一周继续放疗至总剂量50～70Gy,再给予腔内微波固化1～4次.结果放射合并微波固化热疗对鼻咽癌的疗效比单纯放疗有明显优势.临床疗效显示治疗组完全缓解达75%.结论正确选择适应证并规范操作,放疗合并微波腔内固化治疗鼻咽癌可以获得更好的临床疗效,值得推广.     

葡萄糖调节蛋白78上调MMP-2和MMP-9促进鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭的作用机制。方法 收集2018年6月—2019年6月手术切除病灶的56例经病理确诊鼻咽癌患者的肿瘤组织作为鼻咽癌组织的研究对象,男40例,女16例;均为初次确诊鼻咽癌,并且尚未经过放/化疗干预。另同期选取进行治疗的50例慢性鼻咽炎组织作为比对,男38例,女12例。用免疫组化分别检测鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中GRP78的表达。CNE1细胞实验分为对照组（CNE1鼻咽癌细胞常规培养,不进行外界干预）、NC组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78-NC后,常规培养）、Sh-GRP78组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78后,常规培养）,转染完成48 h后,可在荧光显微镜下观察到各组细胞内的绿色荧光蛋白（GFP）,PCR检测各组细胞中GRP78的mRNA的表达。Brdu标记检测各组细胞的增殖能力,Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力,小管形成实验检测各组细胞的血管形成能力;双荧光素酶实验分析GRP78和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9的作用,Western blot检测各组细胞GRP78、MMP-2和MMP-9表达水平。结果 与慢性鼻咽炎组织相比,GRP78在鼻咽癌组织中的表达明显升高,Sh-GRP78组CNE1细胞增殖、侵袭和迁移能力、血管形成能力明显增强,差异均具有统计意义（P<0.05）。双荧光素酶实验结果显示MMP-2和MMP-9是GRP78作用的靶基因。与对照组相比,Sh-GRP78组细胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表达水平明显上升,差异均具有统计意义（P<0.05）。结论 GRP78在鼻咽癌组织中存在高表达的现象,并且GRP78靶向调控MMP-2和MMP-9的表达增强CNE1细胞的增殖、侵袭与血管新生的能力。     

鼻咽癌干细胞miRNA表达特征研究

目的 探讨鼻咽癌干细胞的miRNA表达特征.方法 分离扩增CNE2细胞株鼻咽癌干细胞,流式细胞术检测其干细胞标志物CD133和CD44表达活性,并与鼻咽癌细胞6 10B、5-8F、CNE1、CNE2、HONE1及鼻咽上皮细胞NP69进行对比分析,继行肿瘤相关miRNAs的qRT-PCR检测.同时,在以免疫组化法检测不同临床分期鼻咽癌原发灶组织CD133和CD44表达活性基础上,qRT-PCR法分析其特异性miR 200b表达特征及其与临床分期的相关性.结果 CNE2鼻咽癌干细胞以CD133标志物为突出特征,联合检测CD44具有更高敏感性和特异性;在所检测的肿瘤相关miRNAs中,鼻咽癌干细胞以miR 200b活性低下甚至缺失为基本特征,甚至低于高转移潜能鼻咽癌细胞5 8F.鼻咽癌原发灶组织标本干细胞标志物也以CD133为突出特征,并平行表现与临床分期相关的鼻咽癌干细胞特异性miR 200b活性显著低表达趋势.结论 鼻咽癌干细胞以CD133为特征性标志物,miR-200b活性特异性低表达甚至不表达,可能是其特征性分子靶点。     

Flow cytometric analysis of BHRF1 expression prohibiting apoptosis induced by radiation.

The Epstein-Barr virus gene BHRFI has homology with proto-oncogene bcl-2, which can protect cells from apoptosis. In order to investigate the effect of BHRF1 expression on the anti-apoptotic ability of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells after irradiation, a high-BHRF1 expression vector was constructed and transfected into the NPC cell line CNE2. Then, the alteration of proliferation and apoptosis in the cells was tested by flow cytometry after cobalt 60 irradiation. The results showed that BHRF1 expression could increase G1 delay and decrease the cell percentage in S phase before irradiation, and reduce the apoptotic rate of CNE2 cells and increase the cell percentage in S phase after irradiation. The results suggest that BHRF1 expression is able to alter the cell cycle and protect CNE2 cells from apoptosis induced by radiation.     

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

 目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6 LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE 1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE 1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE 1和CNE 1 LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4（death receptor 4,DR4）,死亡受体5（death receptor,DR5）表达差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE 1细胞中caspase 8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase 3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE 1 LMP1细胞,而Bcl 2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式（truncated form of Bid,tBid）和caspase 9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC 1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。     

X射线交错互补修复基因1多态性和EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响

目的　探讨X射线交错互补修复基因1（X-ray repair cross-complementing gene 1,XRCC1）多态性与EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响。方法　将鼻咽癌细胞株分组,使之分别表达不同的XRCC1基因型,转染EB病毒,比较转染前后不同基因型鼻咽癌细胞的基本特性,并检测XRCC1蛋白的表达水平。结果　XRCC1不同基因型的鼻咽癌细胞之间基本特性无明显差异,XRCC1蛋白水平无差异。EB病毒感染后,各组鼻咽癌细胞生长加快、增殖能力变强、迁移速度加快、凋亡率降低,XRCC1蛋白水平无明显改变。EB病毒感染后,194位点突变型的鼻咽癌细胞与280、399位点突变型细胞相比,细胞增殖和迁移能力改变程度较小,差异有统计学意义。其他基因型细胞基本特性及XRCC1蛋白水平无差异。结论　EB病毒感染可增加鼻咽癌易感性,EB病毒感染后XRCC1 194位点的Trp突变型基因可能对鼻咽癌有保护作用。     

鼻咽癌患者外周血γδ T细胞的体外扩增及对鼻咽癌细胞的体外杀伤活性

目的：通过体外扩增鼻咽癌（NPC）患者外周血γδT细胞，研究对NPC细胞体外细胞毒作用，以探讨γδT细胞在NPC免疫机制中的作用。方法：用抗体固相法体外扩增7例NPC患者（NPC组）及6例健康者（对照组）的外周血γδT细胞，以流式细胞仪检测γδT细胞亚型，对MTT法观察不同来源的γδT细胞在不同效靶比条件下，对Daudi、CNE1和CNE2细胞的细胞毒作用。结果：对照组与NPC组外周血γδT细胞经体外扩增，纯度可达到82％以上，其中90％为Vγ/Vδ2亚型；γδT细胞对Daudi、CNE1和CNE2细胞显示出作用强度相同的细胞毒作用（P＞0．05）。随效靶比升高，γδT细胞对CNE1和CNE2的细胞毒作用明显增强，在相同效靶比时对Daudi细胞的细胞毒作用最强。结论：NPC患者外周血γδT细胞对NPC细胞有明显体外杀伤作用。     

鼻咽癌组织细胞凋亡的检测

目的 :探讨鼻咽癌组织放疗后病理改变及其临床意义。方法 :采用TdT酶介导的生物素化dutp缺口末端标记技术和HE染色 ,检测 30例鼻咽癌组织放疗前后的细胞凋亡率 ,并比较放疗前后的组织病理改变。结果 :鼻咽癌组织放疗后的细胞凋亡率明显高于放疗前 ;放疗后的癌细胞分化趋好 ,但到放疗中期时凋亡率有所下降。结论 :鼻咽癌放疗一方面可加速癌细胞的凋亡 ,另一方面可能促使增殖的癌细胞朝分化好的方向发展 ,从而达到治疗目的     

shRNA-hIAP2增强CNE-1鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究

目的构建人凋亡抑制蛋白（ human inhibitor of apoptosis protein2, hlAP-2 ）的shRNA，靶向抑制hlAP-2基因联合放疗，探讨其对CNEl鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响。方法首先采用MTT法确定最佳放射剂量；再构建4条hlAP-2．shRNA沉默片段并用脂质体法转染CNEl细胞，最后采用实时荧光定量PCR（Q—PCR）和免疫印迹法（Westernblot，WB）筛选出最佳沉默shRNA序列；用最佳沉默shRNA序列转染CNEl细胞，分别设置转染放射线照射组与未转染放射线照射组，采用实时定量PCR和WB检测hlAP．2的基因及其蛋白表达；流式细胞术测细胞凋亡，transwell测细胞侵袭能力。结果MTr法明确4Gv为最佳放射剂量；Q-PCR和WB检测结果显示4条hlAP-2-shRNA均能有效抑制hIAP-2mRNA及蛋白表达（P〈0．05），以hIAP-2-shRNA2沉默效果最显著（P〈0．05）；Q—PCR和WB检测结果显示转染hlAP-2-shRNA2后照射组与未转染hlAP-2-shRNA2照射组的CNEl细胞中hlAP-2基因与蛋白表达比较，差异具有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞术检测结果显示转染hIAP-2-shRNA2后照射组比未转染hlAP-2-shRNA2照射组凋亡率差异具有统计学意义（P〈0．05）；transwell检测结果显示转染hIAP-2-shR-NA2后照射组与未转染hIAP-2-shRNA2照射组侵袭能力差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论转染hIAP-2基因沉默后放射可增加鼻咽癌细胞凋亡率，降低其侵袭能力，能够起到放疗增敏作用。     

鼻咽癌放疗后鼻咽部出血原因分析及治疗对策探讨

目的探讨鼻咽癌放疗后鼻咽部出血的原因及治疗对策。方法回顾性分析2012年1月—2017年12月住院的25例鼻咽癌放疗后导致鼻咽部出血患者的临床资料，治疗方法主要包括鼻咽鼻腔填塞、鼻内镜下鼻咽痂皮及坏死肉芽清创、介入治疗、低温等离子手术止血、鼻内镜下鼻咽肿瘤切除术。结果25例患者中，由鼻咽癌复发引起鼻咽出血8例，其中3例大出血死亡；5例由假性动脉瘤引起，其中3例大出血死亡，2例经介入治疗止血；11例为鼻咽放疗后痂皮及肉芽出血，其中有7例经低温等离子手术成功止血，3例经介入后止血，1例经填塞止血；1例不明原因大出血窒息死亡。结论鼻咽癌放疗后鼻咽部出血是致死率高的并发症, 其中以鼻咽癌复发及假性动脉瘤危险性最高。积极检查明确出血原因，采取有针对性的治疗措施，能够有效降低鼻咽癌放疗后出血的死亡率。