霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因CTXΦ基因组的复制功能研究

引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素（CT）的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中，发现一种新的不含ctxAB的CTXΦ基因组，其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXΦ基因组的相应序列无明显同源性，     

O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXФ的诱导及转染性研究

目的　探讨新出现的O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXΦ的来源及其是否可产生感染性的噬菌体颗粒 ,从而造成毒素基因的水平转移。方法　用DNA破坏剂丝裂霉素C诱导噬菌体CTXΦ基因组被四环素抗性基因标记的O139菌株BJ30 ,继而体外转染古典型标准菌株 5 6 9B和O395 ,对获得的四环素抗性的转导菌株进行转染噬菌体基因组的鉴定。结果　序列同源性分析表明 ,BJ30菌株中的rstR基因与O1群ElTor型菌株的rstR基因完全一致 ;丝裂霉素C诱导获得了感染性噬菌体颗粒 (CTX TcΦ) ,并成功感染O1群霍乱弧菌 5 6 9B和O395 ,转染率分别为 1.0 4× 10 - 4 和 3.2 7× 10 - 6 。结论　O139群霍乱弧菌能产生感染性CTXΦ颗粒 ,ElTor型菌株不是产生CTXΦ的唯一来源。     

霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因 CTXФ基因组的复制功能研究

引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素(CT)的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中,发现一种新的不含ctxAB的CTXФ基因组,其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXФ基因组的相应序列无明显同源性,其他的基因很保守,也不含ctxAB基因,命名为nct-CTXO139Ф.     

霍乱弧菌不携带毒素基因的溶原性噬菌体nct-CTXΦ基因组RS区具有复制与整合功能

目的 研究霍乱弧菌中不携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌CTXΦ基因组（nct-CTX^classΦ）的RS区的复制与整合功能。方法 将这种噬菌体基因组的RS区克隆到不能在霍乱弧菌中复制的自杀质粒载体中，经接合转入含CTXΦ的整合位点attRS、但不含CTXΦ基因组的O1群El Tor型和O139群菌株中，分析含RS的重组自杀质粒在这些被接合菌株中的存在形式。结果 克隆了RS区的重组自杀质粒高频接合入受体菌中，在这些被接合菌株中既发生了染色体整合，同时又以质粒的形式存在于菌细胞内。结论 霍乱弧菌不携带霍乱毒素基因的CTXΦ基因组的RS区仍具有整合与质粒复制功能，可介导该基因组的复制与染色体整合。     

一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ

目的 探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构。方法 从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，并进行电镜观察。从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA，并进行链型分析。对pCTAK进行酶谱分析。用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测，用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测；用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329，将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29，用GM1－ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达。对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序，并用DNASTAR软件和BLAST算法，在国际互联网上对测序结果进行序列分析。结果 发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK，它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中；酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱，在CTX元件中相当保守的酶切位点：BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ，在pCTAK中没有切点。ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性，RS1探针杂交呈阳性；pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性。pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT。从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，电镜观察并计算其直径大小为7nm左右。其全基因组大小为8.5kb，为单链DNA。结论 发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ。     

霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组

目的近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ｃｔｘＡＢ由其溶原性噬菌体ＣＴＸΦ编码,这种丝状噬菌体可携带ｃｔｘＡＢ传递给无毒素基因的霍乱菌株。研究认为ｃｔｘＡＢ基因与ＣＴＸΦ基因组中的其它基因是严格共存的。然而在本实验室研究中,于不含ｃｔｘＡＢ基因的ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌（ＥＶＣ）中发现部分菌株含有ＲＳ基因同源序列,为此对这些菌株作ＣＴＸΦ基因组的进一步研究。方法以ＣＴＸΦ基因组中的ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐ和ＲＳ１结构基因制备探针,对ｃｔｘＡＢ－菌株染色体作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,并用ＰＣＲ方法检测ＣＴＸΦ的感染受体毒素共调菌毛（Ｔｃｐ）的ｔｃｐＡ基因。结果发现有４株分离自河水的霍乱毒素基因阴性ＥＶＣ菌株仍含有溶原噬菌体ＣＴＸΦ的基因组,为ｃｔｘＡ－ｃｔｘＢ－ｚｏｔ＋ａｃｅ＋ｃｅｐ＋ＲＳ＋菌株,另有一株分离自病人的ＥＶＣ菌株仅表现为ＲＳ＋。这些菌株均含ｔｃｐＡ基因。结论ｃｔｘＡＢ基因并不一定与ＣＴＸΦ其它基因共存于一个菌株中,发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体ＣＴＸΦ基因组内可以不携带毒素基因ｃｔｘＡＢ的存在形式     

临床来源nct-CTXΦ样霍乱弧菌基因的多样性分析

目的了解临床来源霍乱弧菌nct-CTXΦ(不含霍乱毒素基因的CTXΦ)样基因特征。方法对6株于2000-2004年自杭州散发腹泻患者分离的ctxA-、tcpA O1群霍乱弧菌核糖体基因分型,PCR检测zot、ace、cep基因及串联CTXΦ基因组拷贝间的相邻片段;以zot、ace、cep基因探针South- ern blot分别检测nct-CTXΦ样基因的PstⅠ、HindⅢ、MluⅠ、BglⅡ酶切及HindⅢ、MluⅠ双酶切的限制性酶切长度多态性,结合拷贝间相邻片段HindⅢ酶切位点分析,构建nct-CTXΦ样基因组物理图谱。结果6株O1群霍乱弧菌中,核糖体基因分型为2种型别;1株无CTXΦ或nct-CTXΦ样基因组,5株存在nct-CTXΦ样基因组,且此5株菌株中存在3种类型nct-CTXΦ样基因组组成,分别为单拷贝长约6 kb串联双拷贝、单拷贝长约5.8 kb的串联双拷贝和串联4拷贝(2个单拷贝长约6 kb,另2个单拷贝长约5.8 kb)。结论nct-CTXΦ霍乱弧菌可能具有引起腹泻的能力;临床和环境来源的霍乱弧菌中存在着一类多样性的nct-CTXΦ样噬菌体家族。     

O139群霍乱弧菌染色体中整合两种CTXΦ前噬菌体基因组的多样性

目的：研究同时携带两种CTXφ基因组的O139群霍乱弧菌中CTXφ基因组的多样性。方法:Southern blot检测分离自福建的部分O139霍乱弧菌菌株中ctxAB和zot基因的多态性，然后选取ctxAB和zot基因拷贝数差异较大的3株菌，扩增其调控抑制基因rstR基因片段，克隆并进行序列测定、分析。结果：此3株菌染色体zot杂交条带多于ctxAB2－5条，提示1个菌株染色体上有编码ctxAB的CTXφ以及不编码ctxAB的CTXφ两种基因组。以保守区设计的引物扩增此3株菌的rstR区，均得到2条大小 不同的条带，分别克隆后进行测序，经GenBank同源性检索，发现在此3个菌株染色体中分别有来自El Tor型的CTX^ETφ与不编码ctxAB的nct-CTX^0139φ、来自加尔各答型的CTX^calcφ与nctCTX^0139φ、以及CTX^ETφ与新报道的一种具有独特rstR序列的CTXφ类基因组两两共存于1个菌株染色体上。这3个菌株还具有不同的16S核糖体基因杂交图谱。结论：不同rstR序列的CTXφ基因组可以共存于1个菌株染色体中，提示CTXφ家族进化过程中的复杂分化，CTXφ家族在不同霍乱菌株间的出现及传递、在霍乱弧菌菌株的变异分化中具有相关性。     

El Tor型霍乱弧菌口服活疫苗候选株IEM108的构建

目的 构建能够诱导抗菌抗毒素免疫和抵抗CTXΦ转染的霍乱弧菌生物安全性口服活疫苗候选株。方法 以不产毒的EI Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEMl01为出发菌株，以管家基因thyA为选择压力，在IEMl01的thyA基因缺失株IEMl01-T中，通过质粒．染色体致死平衡系统表达霍乱毒素B亚单位基因ctxB和介导CTXΦ噬菌体免疫的rstR基因。在家兔模型中，通过检测血清杀弧菌抗体和抗CTB的IgG抗体来评价该新建疫苗候选株的免疫原性；以对家兔攻毒试验后肠段积液量来评价其保护力。结果 含ctxB、rstR和大肠杆菌来源的thyA基因的重组质粒在：IEMl01-T中稳定存在，GMI-ELISA检测ctxB基因能够很好表达。动物试验表明，该新建疫苗候选株能刺激机体产生高滴度的血清杀弧菌抗体和抗CTB IgG抗体，能较好抵抗至少4μg纯品CT和不同毒株的攻击。结论 应用质粒．染色体致死平衡系统构建了能抵抗CTXΦ转染和稳定表达ctxB的生物安全性抗菌抗毒口服活疫苗候选株，其在家兔模型中有较好的免疫原性和保护力。     

El Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEM108抗CTXΦ转染的生物安全性试验

CTXΦ超免疫是由rstR介导的 ,rstR抑制后转染进入CTXΦ中rstAB基因表达所引发的基因组复制与整合。Davis等〔1〕 以rstR抑制携带CTXΦ基因组的重组自杀质粒在菌细胞内的复制来研究rstR的作用 ,我们简化了rstR对rstAB转录表达抑制的实验模型 ,采用比较克隆有RS区的重组自杀质粒接合转移频率的方式来进行安全性评价。将EVC的RS序列克隆到自杀质粒pKTN70 1中 ,该自杀质粒本身在霍乱弧菌中不能复制 ,由于RS区内含与质粒复制起始功能相类似的区域〔2〕,因此 ,重组自杀质粒能在霍乱弧菌中复制。若该菌株内先存在功能性的rstR ,则抑制…     

O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株的构建及鉴定

目的构建O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株。方法PCR扩增TLC上游片段（TLCup）、RTX下游片段（RTXdown）,克隆入pU18中,再在两者间插入氯霉素抗性（Cm）基因,获得重组质粒pUC18-TLC up—Cm-RTX down。酶切回收TLC up—Cm—RTX down片段,克隆入自杀质粒pDS132,构建重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm—RTX down。通过接合将重组自杀质粒转入O139群霍乱弧菌ZJ199693,20％蔗糖选择培养基（Cm抗性）筛选TLC、CTX、RTX基因缺失株。结果PCR、酶切证明重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm-RTX down构建正确。PCR证实O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX毒力基因簇成功缺失。结论成功缺失O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX基因簇．为进一步研究其功能和疫苗构建打下基础。     

霍乱弧菌ct—B基因替代溶原性噬菌体非必需区的研究

首先利用转座因子诱变的方法，分离一些不释放噬菌体的突变子，然后通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方法证明转座因子插入的位置在Ｏ１３９群霍乱弧菌９３Ｘ１１噬菌体基因组中部的ＨｉｎｄⅢ大片段上。由此推测９３Ｘ１１噬菌体基因组非必需区位于两侧。采用低熔点胶回收与染色体相邻的ＨｉｎｄⅢＢ片段，利用体外重组方法使外源基因替代Ｂ片段上的０．７８６ｋｂＥｃｏＲⅠ小片段，通过同源重组将这种改变的Ｂ片段重组到正常的９３Ｘ１１噬菌体基因组Ｂ片段位置上。结果表明，这种外源基因并不影响该噬菌体的溶原性和免疫性。由此认为，这一替代区域属９３Ｘ１１噬菌体基因组上非必需区。然后对它进行核酸序列测定。通过基因重组的方法霍乱弧菌保护性抗原基因ｃｔ－Ｂ取代了溶原性噬菌体基因组上的非必需区。利用ＧＭ１－ＥＬＩＳＡ方法检测ｃｔ－Ｂ的表达，结果表明，ｃｔ－Ｂ表达良好，并且分泌至胞外。重组菌苗免疫家兔后的血清稀释度在１∶４０时，能抵抗１０６ＣＦＵ／ｍｌ毒株的攻击。因此，该重组菌苗可能成为霍乱弧菌很好的菌苗候选株。     

HPI毒力岛缺失的EAggEC17-2突变菌株的构建及其功能研究

目的 构建HPI毒力岛缺失的EAggEC17-2突变株，初步研究EAggEC菌株携带的耶尔森菌HPI毒力岛合成铁载体Ybt的功能。方法以EAggEC17-2为出发菌株，irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列，irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列，中间插入有氯霉素（Can）抗性基因（cat基因）标记。通过接合转移和同源重组，构建了缺失约24kb的HPI毒力岛功能核心区区域EAggEC17-2的仝岛缺失株EA85。应用流式细胞技术（FACS）检测指示菌株WA-CS irp1：：KN（pC3G3．3N）荧光强度的变化情况，对EA85缺失株和出发菌株进行了合成Ybt的功能比较研究。结果成功构建了EAggEC17-2HPI全岛缺失株EA85。EAggEC17-2菌株具有表达Ybt的功能，而缺失株EA85丧失了合成Ybt的能力。结论EAggEC17-2HPI毒力岛的缺失，使Ybt的合成彻底阻断。EAggEC17-2具有的合成Ybt的功能是由其染色体携带的HPI毒力岛所决定的。     

CTXФ在霍乱弧菌两个染色体上的整合分析

目的 研究是否可以在没有TLC(toxin-linked cryptic)因子的非产毒霍乱弧菌染色体上整合,以及是否可以在霍乱弧菌小染色体上整合.方法 筛选染色体上没有整合CTXФ及TLC基因组的霍乱菌株(CTX-TLC-),检测这类菌株染色体上是否有类似的CTXФ染色体整合位点attB.以含有CTXФ的RS区及整合位点的自杀质粒pKRSn与pKRSe结合转移到CTX-TLC-及CTX-TLC+菌株,观察染色体整合情况,并分析整合位置的序列.结果 CTX-TLC-菌株存在与CTXФ染色体整合位点相似的序列.在CTX+TLC-菌株当中,CTXФ基因组存在于小染色体上.自杀质粒pKRSn与pKRSe可以在TLC+及TLC-菌株的大染色体发生整合,也可以在TLC-菌株的小染色体发生整合.结论 CTXФ可以在霍乱弧菌的两条染色体上通过高度相似或一致的attB位点发生整合,另外也提示TLC在CTXФ的大染色体整合中可能发挥作用.     

霍乱弧菌O139与O1及非O1菌关系的研究

霍乱弧菌O139是近年来出现的新型霍乱弧菌,其与O1和其它非O1霍乱弧菌之间的关系是急待解决的问题。本工作应用核酸脉冲场凝胶电泳、基因探针分子杂交、多位点酶电泳和聚合酶链式反应等分子生物学方法,对霍乱弧菌O139、O1和其它非O1的分子生物学特征进行研究。结果表明,霍乱弧菌O139具有O1流行株的主要毒力因子基因,其基因组特征也与O1群流行株相似,但相互之间有微小的差异。分子生物学数值分类表明,霍乱弧菌O139与霍乱弧菌古典型和埃尔托型流行株为一个克隆群,O139菌株与埃尔托型非流行株和其它非O1霍乱弧菌的遗传关系较远,因此O139菌株应列为霍乱病原菌。结果显示,作为霍乱的病原体,不论其表型如何,都具有特定的基因组特征和毒力基因特征。     

鼠伤寒沙门菌肠毒素基因功能 与毒力作用的研究

目的 研究确定肠毒素基因（enterotoxin gene,stn)在鼠伤寒沙门菌致病机理中的功能和毒力作用。方法 以鼠伤寒沙门菌株2000为研究对象,在克隆的stn基因Sfi I位点拼接入Km抗性标记基因以形成stn基因的插入失活,以此构建带有突变stn基因的重组自杀载体质粒,使重组自杀载体质粒与菌株2000染色体的同源基因发生交换,以突变stn基因置换其野生型拷贝,造成菌株2000stn基因位点的专一突变,筛选获得同源突变菌株。利用stn基因、Km抗性基因和自杀载体作探针进行菌株染色体Southern blot杂交,检测菌株对小鼠肠腔结扎攻毒实验和小鼠口服菌株半致死量的指标。结果 菌株2000染色体上野生型stn基因已被突变stn基因取代,同源突变菌株造成小鼠肠腔分泌能力比野生菌株明显减弱（P＜0．01）,小鼠口服突变菌株的致死剂量较野生菌株明显增高（P＜0．01）。结论 stn基因产物能够诱发小鼠肠腔液体分泌反应,stn基因是鼠伤寒沙门菌感染机制中一个较为重要的毒力因子。     

霍乱弧菌减毒活疫苗候选株IEM109的构建

目的构建保护性抗原基因整合于染色体上的霍乱弧菌活疫苗候选株，减弱毒力和增强其遗传稳定性。方法以我们筛选的天然不含霍乱毒素的疫苗候选株IEM101为出发株，通过基因重组技术将IEM101染色体上与噬菌体复制整合有关的TLC因子、attRS位点及具细胞毒作用的RTX基因簇同时进行缺失，并插入具免疫原性的ctxB基因及介导噬菌体免疫的rstR基因，构建疫苗候选株IEM109。GM1-ELISA法检测1EM109中ctxB基因的表达情况。细胞培养观察候选株对哺乳动物细胞Hep-2的毒性作用。结果PCR及原位杂交均证实霍乱弧菌疫苗候选株IEM109中TLC因子、attRS位点、rtxA、rtxC基因被缺失，而ctxB、rstR基因整合人染色体DNA。GM1-ELISA示ctxB基因表达良好。IEM109对Hep-2细胞的毒性作用消失。结论构建了出发株染色体上毒力相关基因簇被保护性抗原基因替换的重组改造菌株，可作为候选株进行进一步的免疫效果考核。     

一株来自我国海南的O139霍乱弧菌与8株国外流行菌株特性比较

一株由海南某地一名霍乱患者水样便中分离的Ｏ１３９霍乱弧菌，通过表型和遗传特性测定；并与来自印度等国家的８株Ｏ１３９霍乱流行菌株作比较，结果证实此海南菌株具有与国外Ｏ１３９流行菌株相同的特性；它属于ＨｅｉｂｅｒｇＩ群，具Ｏ１群霍乱弧菌相同的生化特性，但对弧菌抑制剂（Ｏ／１２９）不敏感，它不能被Ｏ１群多价血清凝集，也不与其他型非Ｏ１群血清产生凝集。不能产生Ｏ１群霍乱弧菌的杀菌抗体。但携带与Ｏ１群霍乱弧菌同源性毒素（ＣＴ）基因，并能表达，在其培养物上清中可测到ＣＴ活性。     

痢疾菌体内诱导基因表达文库的构建

目的 构建筛选痢疾菌福氏2a体内诱导基因的融合基因表达文库。方法 以自杀载体pGP704为骨架，用氯霉素乙酰转移酶基因作为报告基因，构建了用于筛选体内诱导基因的载体pGP-cat。把痢疾菌福氏2a基因组DNA的随机酶切片段（0．6－1kb)亚克隆到pGPcat载体报告基因上游的BglⅡ位点，构建了融合基因文库。结果 与痢疾菌福氏2a2457T结合转移后，获得融合基因表达文库。以氯霉素为选择标记，经过体外初步筛选，得到3．2％的具有氯霉素抗性的菌株。结论 构建的融合基因表达文库适用于筛选福氏2a痢疾菌的体内诱导基因。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR缺失株的构建及其功能的研究

目的　通过构建霍乱弧菌toxR基因缺失株来研究toxR基因对霍乱弧菌减毒菌株IEM101和高产毒株569B毒力表达的调控作用。方法　采用自杀性质粒和接合转移技术，将2个中间含有四环素基因的toxR基因分别与霍乱弧菌减毒株IEM101和高产毒株569B染色体toxR基因重组，从而获得toxR基因缺失株IEM101-4和569B-43，并对2个toxR基因缺失株和其原出发菌株的霍乱肠毒素的产率和主要外膜蛋白图谱进行比较。结果　采用GM1-ELISA检测受测菌CT基因表达，toxR基因缺失株569B-43的P/N值为1.82，而其原出发菌株569B的P/N为4.52，而IEM101和其toxR基因缺失株的P/N值均低于2。采用SDS-PAGE对受试菌外膜蛋白进行分析，toxR基因缺失株569B和IEM101的外膜蛋白图谱相比，均多出2条相对分子质量（Mr）为40×103和43×103外膜蛋白区带。结论　toxR蛋白是霍乱肠毒素基因ctx表达的正调控因子，是霍乱弧菌主要外膜蛋白（Mr为40×103和43×103)编码基因的负调控因子。