组织块法结合胰蛋白酶消化法培养分离人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞

目的介绍组织块法结合胰蛋白酶消化法培养、分离人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞。方法选择10例患者第三磨牙拔除时切除的龈瓣,大小为(1×0.5)cm~2/块。将带有上皮层和固有层的组织块种植于培养瓶中,待组织块细胞增殖后,通过胰蛋白酶消化法分离获得原代上皮细胞和成纤维细胞。采用免疫荧光和HE染色进行细胞鉴定。结果组织块植入后的第2 d~3 d可看到组织块周边出现新分裂增殖的细胞,14 d细胞增殖达到0.5 cm~1.0 cm后,进行初次传代。胰蛋白酶消化法可初步分离出上皮细胞和成纤维细胞。通过在不同培养基中的传代培养,2种细胞可以获得进一步纯化。结论组织块法结合胰蛋白酶消化法能快速高效的培养分离口腔上皮细胞和成纤维细胞,是一种实用的口腔黏膜细胞培养方法。     

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

恒河猴精原干细胞的筛选、培养与鉴定

目的:建立恒河猴精原干细胞的筛选和培养方法。方法:采用改良的二步酶消化法分离恒河猴睾丸细胞,用改进的差异贴壁筛选法纯化恒河猴精原干细胞,用添加了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、可溶性GFRα1和bFGF的DMEM/F12无血清培养基和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养恒河猴精原干细胞,并通过形态观察、标志基因的免疫细胞化学分析和半定量RT-PCR分析鉴定培养细胞的干细胞活性。结果:分离纯化的恒河猴精原干细胞在添加了3种生长因子的培养基中能形成较大的干细胞克隆,并表达精原干细胞的标志基因。结论:本研究初步建立了恒河猴精原干细胞的培养体系,为进一步开展相关研究奠定基础。     

香烟烟雾吸入致大鼠肺与气管上皮细胞RAGE和S100A6表达增加

目的观察香烟烟雾长期染毒大鼠肺组织、气管上皮细胞中晚期糖基化终产物受体（RAGE）和钙结合蛋白（S100A6）的表达。方法健康雄性Wistar大鼠18只,随机分为对照组、低（烟雾浓度20%）和高（烟雾浓度60%）浓度组,每组6只。动式气体染毒装置每天染毒2次,每次30min,一周5d,共染毒43周。分离大鼠气管和肺组织,分离原代上皮细胞,收集并提取总蛋白;Westernblot方法检测RAGE和S100A6蛋白的表达。同时测定正常的人支气管上皮细胞株BEAS-2B和肺癌细胞株A549中2种蛋白的表达情况。结果气管组织贴块培养法分离出的上皮细胞纯度为（93.56±1.48）%;烟雾染毒组大鼠肺组织及气管上皮细胞中RAGE和S100A6蛋白的表达均显著增高。同时,肺癌细胞A549中RAGE及S100A6蛋白的表达量明显高于正常人支气管上皮细胞BEAS-2B。结论RAGE和S100A6有望作为香烟烟雾暴露致肺损伤的生物学标志。     

氡及其子体对大鼠肺组织的辐射损伤研究

目的研究氡及其子体对大鼠气管-支气管上皮细胞影响和肺组织病理学改变,从miR-34a(microRNA-34a)角度阐述肺损伤的机制。方法将SD大鼠置于多功能生态氡室,使其暴露于氡及其子体中,额外累积暴露剂量分别达90、120工作水平月(WLM)后,提取气管-支气管上皮细胞,分离收集肺组织,做病理学检查,检测肺组织中miR-34a的表达水平。结果与对照组大鼠比较,氡暴露组大鼠肺组织中出现类型、程度、范围多样性的病理学改变,主要表现为肺间质充血、水肿、炎症细胞浸润、纤维性蛋白增生、肺气肿等多种病变;氡暴露90 WLM组气管-支气管上皮细胞的存活率从100%降到73.2%,氡暴露120WLM组降到60.2%;氡暴露90 WLM组气管-支气管上皮细胞的集落形成率从100%降到74.3%,氡暴露120WLM组降到61.9%。90WLM组肺组织中miR-34a表达量为7.04,120WLM组表达量为6.26,均较对照组miR-34a表达量(6.03)升高。结论氡及其子体可造成SD大鼠肺组织的病理性损伤,气管-支气管上皮细胞存活率和集落形成率降低;miR-34a通路在氡暴露SD大鼠肺组织损伤中发挥一定作用。     

香烟烟雾吸入致大鼠肺与气管上皮细胞RAGE和S100A6表达增加

目的观察香烟烟雾长期染毒大鼠肺组织、气管上皮细胞中晚期糖基化终产物受体（RAGE）和钙结合蛋白（S100A6）的表达。方法健康雄性Wistar大鼠18只,随机分为对照组、低（烟雾浓度20％）和高（烟雾浓度60％）浓度组,每组6只。动式气体染毒装置每天染毒2次,每次30min,一周5d,共染毒43周。分离大鼠气管和肺组织,分离原代上皮细胞,收集并提取总蛋白;Western blot方法检测RAGE和S100A6蛋白的表达。同时测定正常的人支气管上皮细胞株BEAS-2B和肺癌细胞株A549中2种蛋白的表达情况。结果气管组织贴块培养法分离出的上皮细胞纯度为（93．56±1．48）％;烟雾染毒组大鼠肺组织及气管上皮细胞中RAGE和S100A6蛋白的表达均显著增高。同时,肺癌细胞A549中RAGE及S100A6蛋白的表达量明显高于正常人支气管上皮细胞BEAS-2B。结论RAGE和S100A6有望作为香烟烟雾暴露致肺损伤的生物学标志。     

大鼠血清培养液对食管癌细胞增殖影响

目的筛选食管癌细胞增殖培养液中大鼠血清的最佳浓度和活性状态。方法采用常规饲料喂饲大鼠30d,股动脉采血制备血清,采用不同浓度和活性状态的大鼠血清培养液培养人食管上皮鳞癌细胞株Eca-109,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法,筛选大鼠血清培养液对Eca-109细胞生长增殖的最佳作用条件,以小牛血清培养液及人正常肝上皮细胞株HL7702作为对照进行比较。结果各浓度未灭活大鼠血清培养的人食管癌细胞Eca-109基本上均呈指数增长趋势,72h时各浓度组间差异有统计学意义(F=159.263,P0.05);用5%未灭活大鼠血清培养人食管癌细胞Eca-109和人正常肝上皮细胞HL7702,培养72h时,2株细胞的生长增殖能力均强于5%灭活大鼠血清,差异均有统计学意义(F=37.746,P0.05;F=43.399,P0.05);与小牛血清对2株细胞生长增殖的作用接近(P0.05)。结论 5%相同浓度条件下,未灭活大鼠血清培养液更适合细胞生长。     

云锡矿尘致大鼠气管上皮细胞转化的研究

用大鼠气管上皮细胞体内—体外转化系统检测可能致癌的云南锡业公司（简称云锡）矿场沉积尘的致癌性。云锡矿尘、青石棉尘对Ｗｉｓｔａｒ大鼠气管灌注染尘，ｌ５ｄ后取其气管上皮细胞体外无血清培养，１周后用含血清的选择培养基培养，在接种大鼠气管上皮细胞５～６周后计数转化集落数。结果表明云锡矿尘剂全为３０～１２０ｍｇ／只、青石棉为２２，５ｍｇ／只，有剂量效应关系。提示云锡矿尘可能是云南锡业公司矿工肺癌高发的主要原因。并证明大鼠气管上皮细胞体内—体外转化系统是研究矿尘类物质致癌性的良好模型。     

氡暴露对大鼠气管-支气管上皮细胞转化影响

在人类生活环境的天然本底辐射中，由于吸入氡及其子体所产生的辐射剂量约占54％，氡暴鳝导致的健康危害，已成为近年来的研究热点。大鼠气管一支气管上皮细胞是研究氧暴露生物效应的良好模型，但由于受到染毒装置等条件的限制．过去多进行体外研究。本实验利用多功能移动式氡室对大鼠动态吸入染毒，利用建立的动物模型，采用消化后刷洗法分离得到大鼠气管一支气管上皮细胞，观察氡染毒后靶细胞体外发生转化的过程，探讨氡暴露对细胞的损伤效应。     

氡及其子体诱发大鼠体细胞HPRT基因位点的突变

[目的]用多核细胞法研究氡及其子体诱发大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因位点突变情况。[方法]Wistar雄性大鼠24只,采用HD-3型多功能移动式氡室进行动态吸入染毒,按照氡染毒的累计暴露量,分为3个实验组和1个对照组;获取大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞,以多核细胞法检测该两种细胞的HPRT基因突变频率。[结果]大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变频率均随氡累积暴露剂量的增加而相应增加,剂量-效应关系明显,拟合的函数分别为(?)=1.785×10~(-5)D~2 1.174×10~(-3)D 1.054和(?)=3.538×10~(-5)D~2 8.338×10~(-4)D 1.032。[结论]氡及其子体能诱发大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变,呈现一定的剂量-效应关系。     

Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells

Defined culture conditions are essential for the interpretation of effects caused by volatile substances on human nasal epithelial cells (HUNEC) cultured in vitro. Conventionally, serum-containing media are used. However, the results of these experiments are of restricted value as serum contains many unknown and undefined substances. Not all serum-free media on the market are suitable for culturing primary HUNEC. Therefore, serum-free defined cell culture media were compared to evaluate optimal conditions for HUNEC and their cell lines. HUNEC were generated by trypsin digestion of mucosal tissue of the inferior turbinate. Cells were cultured on uncoated polystyrene dishes adding pre-warmed medium. Viability was controlled by trypan blue dye exclusion; colony forming units and cell morphology were controlled microscopically. The expression of different cytokeratins was studied immunocytochemically. Dulbecco's modified Eagle's medium was not suitable to grow HUNEC and passage them. HUNEC cultured in bronchial epithelial growth medium presented a more homogeneous cell morphology compared to other media and had a doubling time of 1.2 days. The maximum number of cell passages was 11 with bronchial epithelial growth medium.     

乳鼠心肌细胞原代培养方法

目的:探讨新生乳鼠心肌细胞原代培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的心肌细胞。方法:参照Simpson等的方法加以改进,采用含0.05%EDTA的胰蛋白酶多次消化心肌,差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。用台盼蓝染色法检测培养细胞的存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化,记录3 d、6 d、9 d、12d心肌细胞搏动频率,测定细胞活力。结果:原代培养乳鼠心肌细胞生长良好,培养3 d、6 d、9 d、12 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于96%,培养12 d时仍为97.02%。在倒置显微镜下观察,培养48 h左右的细胞之间相互连接的并有细胞搏动。培养6 d、9 d、12 d的细胞与培养3 d的相比,活力增强,差异显著(P<0.05),从6 d开始,细胞活力并未显著增强,两两比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

高脂膳食对人肺腺癌细胞SPCA1增殖活性影响的血清生理学研究

目的探讨用血清生理学方法直接在细胞水平上研究高脂膳食对人肺腺癌细胞系SPCA1增殖活性的影响。方法在探讨合适的血清生理学实验条件后,将20只SD雌性大鼠按体重随机分为高脂组和对照组,对照组自由进食普通饲料,高脂组自由进食高脂饲料(猪油∶普通饲料=1∶9),喂养7周后取血分离血清,用大鼠血清代替细胞培养液中小牛血清培养人肺腺癌细胞系SPCA1,用MTT比色法、3HTdR掺入法、流式细胞术检测方法从细胞生长曲线、细胞DNA合成以及细胞周期分布等方面观察高脂膳食喂养的雌性大鼠血清对癌细胞增殖活性的影响。结果(1)加入细胞培养液中血清浓度为15%时,人肺癌细胞生长较好,并且未灭活组好于灭活组。(2)从MTT比色法、3HTdR掺入实验以及流式细胞术结果来看,高脂膳食喂养的大鼠血清(RSTHFD)能促进肺腺癌细胞SPCA1的增殖和癌细胞DNA的合成,并能促使细胞进入活跃的有丝分裂状态。结论(1)用血清生理学方法可以直接在细胞水平上研究膳食因素对人肺腺癌细胞系SPCA1增殖活性的影响。(2)高脂膳食能促进人肺腺癌细胞SPCA1的增殖。     

盐亭食管癌高发区饮食对人食管癌细胞增殖的影响

目的采用血清生理学方法,观察盐亭食管癌高发区饮食喂饲大鼠血清对人食管癌细胞Eca-109生长增殖的影响。方法将24只雄性SD大鼠分为3组,分别喂饲大鼠常规饲料、健康成人饮食及盐亭饮食7天,每天定时记录采食量及体重。用MTT法探讨用大鼠血清培养人食管癌细胞的适宜条件;分别以人正常肝上皮细胞HL7702及10%灭活小牛血清作为对照,采用细胞生长曲线、细胞群体倍增时间、3H-TDR掺入实验研究盐亭饮食喂饲大鼠血清对人食管癌细胞生长增殖的影响。结果喂饲健康成人饮食与常规饲料的大鼠其采食量及体重无差异;用5%未灭活大鼠血清取代10%灭活小牛血清适合人食管癌细胞培养;盐亭食管癌高发区饮食喂饲大鼠血清可明显促进人食管癌细胞生长,却不利于人正常肝上皮细胞生长,且与其他3个组均有统计学差异(P<0.05)。结论盐亭食管癌高发区饮食具有促进人食管癌细胞Eca-109生长增殖的作用。     

芬太尼对MCF-7乳腺癌细胞增殖及迁移和凋亡的影响

目的：探讨芬太尼对MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法：将MCF-7乳腺癌细胞分为6组,正常对照组（C组）,芬太尼组（F1组、F2组、F3组、F4组、F5组）,芬太尼的终浓度分别为1、O．1、0．01、0．001、0．0001μmol／L,在含去激素新生小牛血清的无酚红培养基培养条件下,分别采用MTr法、划痕实验、AnnexinV—FITC细胞凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪观察芬太尼对MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。结果：芬太尼组各组OD值、迁移距离和凋亡率与C组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：在含去激素新生小牛血清的无酚红培养基培养条件下,芬太尼对MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡无明显影响。     

同型半胱氨酸促进血管平滑肌细胞增生的实验研究

目的 :　研究同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)是否促进平滑肌细胞增生。方法 :　SD大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养 ,随机分为 5组 :1 .正常对照组 ,2 .1 .0 mmol/L Hcy组 ,3 .2 .5 mmol/L Hcy组 ,4.5 .0 mmol/L Hcy组 ,5 .1 0 .0 mmol/L Hcy组。培养 72 h后 ,采用细胞毒试验、流式细胞仪检测细胞生长情况。 2 0只 SD大鼠进行体内观察 ,随机分为高蛋氨酸组 (M组 )和对照组 (C组 ) ,M组每日给予含蛋氨酸 3 %的饮食 ,在 1 2 w进行主动脉病理学光镜和电镜检查。结果 :　 1 .细胞毒试验观察到 Hcy促进平滑肌细胞生长与增殖 ;2 .流式细胞仪检测可见 Hcy促进平滑肌细胞由 G1期进入合成的 S期 ;3 .在 4w时 ,高蛋氨酸组大鼠即出现高同型半胱氨酸血症 ,高蛋氨酸血症 ;4.病理检查光镜下可见高蛋氨酸组大鼠主动脉有明显中膜增厚 ,平滑肌细胞增生 ;5 .电镜检查可见平滑肌细胞肿胀 ,内质网扩张 ,线粒体水肿 ,溶酶体增多。结论 :　同型半胱氨酸促进大鼠血管平滑肌细胞增生     

间接免疫荧光法检测鼠疫杆菌F1抗体

目的构建鼠疫杆菌F1抗原结构基因Caf1的重组载体pCDNA3.1-hisB-Caf1,在NIH3T3细胞中稳定表达,并用表达F1抗原的细胞株作为诊断抗原,探讨间接免疫荧光法（IFA）检测鼠血清中鼠疫杆菌F1抗体的可行性。方法将caf1基因克隆到质粒pCDNA3.1-hisB的多克隆位点上,构建重组载体pCDNA3.1-hisB-caf1,重组载体经脂质体转染至NIH3T3细胞中,G418筛选获得抗性细胞株,并以此细胞株为诊断抗原,IFA检测鼠血清中的F1抗体。结果经IFA证实,pCDNA3.1-hisB-caf1能在NIH3T3细胞中稳定表达,并能与1例经ELISA检测为F1抗体阳性的鼠血清发生特异性反应。结论NIH3T3细胞稳定表达的F1抗原可作为IFA中的侯选抗原,检测鼠血清中的F1抗体。     

铅对培养海马神经细胞生长和nNOS表达的影响

目的研究不同剂量醋酸铅对原代培养的海马神经细胞生长和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达的影响。方法将孕18dSD大鼠麻醉后剖腹取出胎鼠,采用海马神经细胞培养建立细胞模型,醋酸铅的染毒浓度分别为10-5mol/L(高剂量组)、10-7mol/L(中剂量组)、10-9mol/L(低剂量组),对照组给予等量培养液。染毒24h后用免疫组织化学法检测神经细胞球和单个神经细胞nNOS蛋白的表达。结果各剂量组对海马神经细胞胞体、轴突突起长度和细胞间连接均未见明显影响。高剂量组和中剂量组海马神经细胞球和散在的神经细胞nNOS的表达明显下降,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。低剂量组海马神经细胞球和散在的神经细胞nNOS的表达较对照组有所下降,与对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。结论低剂量铅下调培养的海马神经细胞nNOS的表达,这种下调作用具有剂量依赖性。     

硒和锌对人食管癌细胞株Eca109生长增殖影响的血清生理学研究

目的观察不同剂量硒、锌灌胃大鼠血清对人食管癌细胞株Eca109生长增殖的影响。方法将SD大鼠随机分为7组(基础饲料组、低硒组、高硒组、低锌组、高锌组、低硒低锌组、高硒高锌组),每组8只。喂养30天后取大鼠血清培养人食管癌细胞株Eca109和人正常肝上皮细胞株HL7702。用AAS法分别测定各组大鼠血清硒、锌;采用MTT法、3H-TDR掺入实验研究不同浓度硒、锌灌胃大鼠血清对两株细胞生长增殖的影响。结果 (1)基础饲料组血清硒、锌水平最低,高锌组血清锌最高;高硒高锌灌胃组大鼠血清硒水平最高,低硒低锌灌胃组血清硒水平次之,均明显高于基础饲料组;而此两组大鼠血清锌与基础饲料喂饲组大鼠血清锌水平差异无统计学意义(P>0.05);(2)与小牛血清对照组相比,只有高硒高锌灌胃组大鼠血清从第72h起抑制癌细胞生长(P<0.05),其余各组均促进食管癌细胞的生长;且该组大鼠血清也抑制肝细胞生长(P<0.05);(3)高硒高锌灌胃组大鼠血清明显抑制食管癌细胞DNA合成(P<0.05),其余各组与对照组作用相近,但该组对肝细胞DNA合成的抑制作用也最强。结论硒、锌在吸收、代谢等方面可能存在相互抑制作用;血清硒、锌含量较低会促进人食管癌细胞的增殖,而增加硒、锌的摄入可提高血清硒、锌的含量且可能抑制癌细胞的增殖。