雷公藤内酯醇对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨雷公藤内酯醇对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过MTT法检测不同浓度的雷公藤内酯和硼替佐米单用及联用对H929细胞的增殖抑制作用;采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明:雷公藤内酯醇(10-100 ng/ml)和硼替佐米(10-100 nmol/L)单用和联用均可抑制H929细胞增殖,呈浓度依赖性,雷公藤内酯醇和硼替佐米联用组的细胞凋亡率明显高于单用硼替佐米组。经非抑制浓度的雷公藤内酯醇(10 ng/ml)联合硼替佐米(40 nmol/L)处理H929细胞24 h后的凋亡率明显高于单用硼替佐米组(P<0.05)。结论:雷公藤内酯醇能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡及分子伴侣BiP表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株NCI—H929（H929）的凋亡诱导作用及其对H929细胞中分子伴侣BiP表达的影响。以不同浓度硼替佐米处理H929细胞24小时后,采用Annexin V—FITC／PI双染联合流式细胞术检测靶细胞凋亡率;用RT—PCR和Westernblot检测靶细胞BiP mRNA和BiP蛋白的表达。结果表明：不同浓度硼替佐米（20、40、80nmol／L）均可诱导靶细胞凋亡,凋亡率分别为（15．73±0．67）％、（27．83±1．26）％7t．（44．17±2．25）％,呈剂量依赖性,且均显著高于未处理组（1．21±0．07％）（P〈0．05）;经不同浓度硼替佐米处理后,靶细胞BiPmRNA和BiP蛋白水平均高于未处理组,且二者变化一致;在相近的促凋亡条件下（凋亡率约40％-50％）,标准内质网应激诱导剂brefeldin A（500ng／ml,24小时）对H929细胞BiP mRNA和BiP蛋白表达的上调作用与硼替佐米（80nmol／L,24小时）基本一致。结论：硼替佐米诱导H929细胞凋亡并伴有分子伴侣BiP mRNA和BiP蛋白表达上调,表明硼替佐米诱导的H929细胞凋亡极可能涉及内质网应激反应。     

伊马替尼衍生物TEB-415对多发性骨髓瘤细胞的作用研究

目的:探究伊马替尼衍生物TEB-415和伊马替尼对多发性骨髓瘤细胞U226,H929,RPMI8226,MM1R和MM1S增殖抑制作用。方法:通过改良伊马替尼的化学基团,合成了伊马替尼的衍生物TEB-415。以不同浓度的TEB-415,伊马替尼和硼替佐米处理U226,H929,RPMI8226,MM1R和MM1S细胞72 h,应用CCK-8法检测细胞的增殖水平,观察细胞形态,并计算IC_(50)。结果:TEB-415可显著抑制H929和RPMI8226骨髓瘤细胞的活力。TEB-415浓度0.1 nmol/L时,50%H929细胞死亡,而伊马替尼半数抑制浓度(IC_(50))为0.123 mol/L,硼替佐米半数抑制浓度(IC_(50))为0.03 nmol/L。TEB-415浓度11.9 mol/L时,50%RPMI8226骨髓瘤细胞死亡,而伊马替尼浓度达到12.8mol/L时,细胞仍然状态良好。结论:TEB-415对多发性骨髓瘤细胞H929的杀伤能力远远强于伊马替尼,仅次于硼替佐米。TEB-415对伊马替尼不敏感的RPMI8226细胞,仍然具有一定的杀伤作用。     

间充质干细胞对多发性骨髓瘤细胞生长及硼替佐米诱导其凋亡的影响研究

目的 探讨间充质干细胞在多发性骨髓瘤细胞生长以及硼替佐米诱导骨髓瘤细胞凋亡中的作用.方法 取15例临床确诊的多发性骨髓瘤(MM)患者以及3名正常供者的骨髓标本,分离其间充质干细胞(MM-BMSC和ND-BMSC);测定细胞生长曲线、免疫表型和细胞因子分泌水平.将骨髓瘤细胞(NCI-H929)与BMSC细胞共培养,并加入蛋白酶体抑制剂硼替佐米,观察BMSC对NCI-H929细胞生长增殖的影响;进一步通过Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测BMSC对硼替佐米诱导NCI-H929细胞凋亡的影响.结果 成功分离得到MM患者以及正常供者骨髓间充质干细胞,FCM检测显示两者均高表达CD73和CD105(＞95%),表达CD44和CD29,不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR(＜1%)等表面分子.生长曲线测定显示MM-BMSC增殖较为缓慢,倍增时间(82 h)较ND-BMSC(62 h)略有延长(P＜0.05).与ND-BMSC比较,MM-BMSC分泌高水平的细胞因子IL-6和VEGF,分别为(188.8±9.4)pg/ml对(115.0±15.1)pg/ml和(1497.2±39.7)pg/ml对(1329.0±21.1)pg/ml.将BMSC与骨髓瘤细胞NCI-H929共培养,MM-BMSC可促进骨髓瘤细胞的生存,降低NCI-H929细胞对硼替佐米的敏感性,明显抑制硼替佐米诱导的瘤细胞凋亡.结论 MM-BMSC可促进骨髓瘤细胞的生长,明显减少蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导的细胞凋亡.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤细胞MM1R的抑制作用

本研究探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589单药或者联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米,对多发性骨髓瘤(MM)细胞的抗瘤效应。采用MTT法检测LBH589(10、20、50 nmol/L)及50 nmol/L分别联合硼替佐米(10、20 nmol/L)作用于人多发性骨髓瘤MM1R细胞24,48 h后的细胞增殖抑制作用;采用流式细胞术检测LBH589对MM1R细胞周期和细胞凋亡的影响;采用Western blot分析LBH589(10、20、50 nmol/L)作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度。结果表明,LBH589单药及与硼替佐米联合均能够抑制MM1R细胞增殖,并与药物浓度和作用时间呈正相关。MM1R细胞经药物作用48 h后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期及S期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期,同时可见MM1R细胞的凋亡率增加,作用呈浓度依赖性,且LBH589与硼替佐米联合作用均较单药作用更加明显(均P<0.001);Western blot分析显示,不同浓度LBH589作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调,呈浓度依赖性。结论:LBH589能够抑制MM1R细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,且与硼替佐米联合对骨髓瘤细胞有协同作用。     

姜黄素联合硼替佐米对骨髓瘤H929细胞增殖抑制与凋亡诱导作用及其机理

本研究旨在探讨姜黄素(curcumin)联合硼替佐米(bortezomib)对人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞系H929细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其作用的相关机理。采用MTT法检测不同浓度的姜黄素和硼替佐米单用或联合应用对H929细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞术(FCM)分析单用和联合用药时细胞的凋亡比率;采用RT-PCR法分析凋亡相关基因BCL-2、BAX及细胞周期相关蛋白cyclin D1的表达变化;采用免疫荧光染色法测定不同处理组NF-κB P65蛋白的分布变化。结果表明:姜黄素和硼替佐米单用及联合应用时均可抑制H929细胞的生长,呈剂量依赖性,联合用药在一定浓度范围内有协同效应;联用组细胞凋亡的比例明显高于单用组及对照组;与单用组相比,联用组cyclin D1,BCL-2基因表达下降,BAX升高。核因子NF-κB P65在单用组的胞核内的表达减弱,联合应用组NF-κB P65蛋白分布于胞浆。结论 :姜黄素与硼替佐米均可抑制H929细胞的生长增殖、促进凋亡,联合应用有协同效应。抑制核因子NF-κB的转录及影响其调节凋亡相关基因可能是作用机制之一。     

PX-12促进硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞H929凋亡的实验研究

目的:研究PX-12对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的影响及机制。方法:以MM细胞株H929细胞为研究对象,将细胞分为PX-12组、硼替佐米组、联合组和对照组,分别加入单药PX-125.0μmol/L、单药硼替佐米20 nmol/L、两药联合和DMSO对照,培养24、48及72 h后观察细胞活性变化,通过MTT法检测MM细胞活性,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布和凋亡情况,H2DCFDA探针标记法测定各组细胞内ROS水平。结果:培养72 h后,PX-12组和硼替佐米组的H929细胞活性均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01),而联合组的细胞活性下降最为显著,且明显低于其他3组(P<0.01)。PX-12组细胞在培养48 h后,G1期的细胞数下降至40%,而S期和G2/M期数目分别上升至28%和40%,硼替佐米组细胞作用后也出现类似的分布现象,而联合组细胞经过PX-12和硼替佐米共同作用后,G1期的细胞明显下降至19%,S期细胞也降至12%,但G2/M期细胞明显上升至68%,与PX-12组和硼替佐米组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。培养72 h后,联合组细胞凋亡率达71.3%,显著高于PX-12组、硼替佐米组和对照组(20.6%、33.3%和10.6%)(P<0.01)。培养24 h后,联合组细胞内ROS水平为12015±430.2,分别高于PX-12组、硼替佐米组和对照组(6729±352.8、2651±228.3和1098±164.6)(P<0.01)。结论:PX-12可以促使硼替佐米诱导MM细胞H929凋亡增加,可能是通过ROS水平升高而导致凋亡增加。     

姜黄素通过抑制Notch1信号通路增强多发性骨髓瘤对硼替佐米的化疗敏感性

目的:探讨姜黄素对耐硼替佐米的骨髓瘤细胞的作用以及对Notch1信号通路表达的影响,进一步探索其潜在的作用机制。方法:分别将姜黄素、硼替佐米及姜黄素+硼替佐米作用于骨髓瘤细胞系RPMI8266、U266、耐5 nmol/L硼替佐米的RPMI 8266(RPMI8226-V5R)、耐5 nmol硼替佐米的U266(U266-V5R)及骨髓瘤CD138+浆细胞,应用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达;利用notch1抑制剂DAPT及RNA干扰技术抑制细胞内notch1表达,重复上述实验。结果:与单药组相比,联合作用组可进一步抑制细胞增殖,增加细胞凋亡,增强对Notch1信号通路的抑制作用(P0.05);而抑制Notch1可以减少细胞的增殖,并增加凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平。结论:姜黄素能够增强骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,此作用可能与Notch1受抑制有关。     

Notch1 siRNA对骨髓瘤细胞硼替佐米药物敏感性的影响

目的探讨Notch1 siRNA对体内外人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞硼替佐米药物敏感性的影响。方法体外采用Notch1 siRNA转染RPMI-8226细胞,CCK-8实验检测细胞增殖及硼替佐米药物的敏感性;Western blot检测各组细胞Notch1蛋白表达变化;将RPMI-8226细胞皮下注射于NOD/SCID小鼠,建立人多发性骨髓瘤(MM)小鼠移植瘤模型,将成瘤小鼠分为三组:NS+bortezomib(Notch1 siRNA转染联合硼替佐米)组;CS+bortezomib(Control siRNA转染联合硼替佐米)组;UN+bortezomib(硼替佐米)组,观察各组肿瘤体积变化,免疫组化染色法观察Notch1变化,TUNEL法检测细胞凋亡。结果 Notch1 siRNA有效下调骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞Notch1蛋白表达;Notch1 siRNA在96 h抑制细胞增殖作用明显增加,与CS及UN组比较对细胞增殖的作用可见明显差异(P<0.01);Notch1 siRNA转染组细胞对硼替佐米IC50值为1.21μmol/L,与Control siRNA转染组及未转染组相比均存在统计学差异(P<0.01);Notch1 siRNA降低移植瘤Notch1蛋白表达,Notch1 siRNA转染组细胞的AI明显高于Control siRNA转染组及未转染组(P<0.01);Notch1 siRNA转染联合硼替佐米组肿瘤体积明显减小,13、17及21 d与Control siRNA转染联合硼替佐米组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论体外实验Notch siRNA抑制人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞增殖增加硼替佐米的敏感性,体内试验证实Notch siRNA联合硼替佐米可以明显减小荷瘤MM小鼠肿瘤体积、增加凋亡,提示Notchl是治疗MM的有效分子靶点。     

硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡机制的深入研究

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡的机制。通过细胞计数检测细胞增殖,用流式细胞仪分析细胞周期和活性氧（ROS）水平,Westernblot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,10nmol／L硼替佐米联合50nmol／L阿糖胞苷对U937细胞有明显增殖抑制作用。两药联合协同诱导细胞凋亡。两药联合较单药处理能明显协同增加U937细胞ROS的水平,并能明显上调U937细胞中p-P38,p-JNK表达,下调p-ERK的表达。结论：硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡．其机制可能与R0s的损伤导致JNK、P38通路的激活和ERK的下调,从而影响细胞线粒体途径有关。     

硼替佐米对K562/DNR细胞株MAPK信号途径的影响

本研究旨在检测硼替佐米对柔红霉素（daunorubicin,DNR）诱导的K562耐药细胞株K562/DNRMAPK信号途径中ERK、JNK及P38的影响,探讨硼替佐米逆转白血病细胞耐药的分子机制。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行耐药细胞株和硼替佐米细胞毒性的判定。选用4μg/L硼替佐米作为实验用药,以100μg/mlDNR单用或联合应用硼替佐米作用于K562/DNR细胞株12、24和36小时,应用Western blot检测不同时间点各组ERK、JNK、p38及P-gp的表达水平,同时应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果表明,与DNR组相比,在总ERK1/2、p38及JNK无明显变化的情况下,硼替佐米联合DNR可抑制P-ERK、P-P38的表达,增加P-JNK的表达（p〈0.05）,同时减少P-gp表达,其作用随作用时间延长而增强,同时加用硼替佐米可增加细胞凋亡率。结论：硼替佐米可通过MAPK信号通路逆转白血病细胞耐药性,增加细胞凋亡率,该作用呈时间依赖性。     

二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用及机制探讨

本研究旨在探讨二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞生物学特性的影响及可能的作用机制。采用不同浓度的二甲双胍处理NB4细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过细胞黏附实验分析药物对细胞黏附能力的影响。采用细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化抑制剂U0126预处理NB4细胞,Westernblot观察ERK磷酸化水平的变化,同时检测细胞凋亡和黏附能力的改变。结果表明,二甲双胍能抑制NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡,增强细胞的黏附能力。5μmol／LU0126预处理有效抑制NB4细胞中ERK的磷酸化,降低5mmol／L二甲双胍诱导的细胞凋亡并减弱细胞的黏附能力。结论：二甲双胍对NB4细胞有抑制增殖、促进凋亡和黏附的作用,MEK／ERK信号通路可能是二甲双胍在NB4细胞中的分子作用机制之一。     

黄酮联合阿霉素协同诱导HL60/ADR细胞凋亡机制的研究

目的:探究黄酮在体外对多药耐药细胞系HL60/ADR的影响及联合阿霉素后对细胞生长抑制和凋亡的作用机制,探讨中药在白血病化疗中扶正、增效的可能性。方法:用CCK-8法检测黄酮和阿霉素对HL60/ADR细胞生长的抑制作用;用流式细胞仪检测药物作用后的细胞凋亡率,并在光镜下观察细胞形态变化;蛋白印迹法检测药物作用后凋亡信号通路蛋白表达的情况;流式细胞仪检测药物作用后HL60/ADR线粒体跨膜电位的变化。结果:黄酮能显著抑制HL60/ADR细胞的增殖,且其抑制细胞增殖效应呈现浓度-时间依赖性;不同浓度的黄酮及联合阿霉素1.5μg/mL(20%抑制浓度即IC20值)后对细胞的抑制作用更明显,具有协同和相加作用。75μg/mL和100μg/mL黄酮能促进HL60/ADR细胞凋亡,而黄酮联合阿霉素的促凋亡作用更显著。蛋白信号通路研究显示,单药黄酮及两药联合能使HL60/ADR细胞线粒体膜电位下降,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表达明显下调,促凋亡蛋白Bim、Bad、Bax明显增加,激活caspase途径;同时磷酸化的P-JNK蛋白表达水平升高,而P-ERK明显下降。结论:黄酮联合阿霉素可通过线粒体跨膜电位的下降,依赖caspase活化调控Bcl-2家族中Bim、Bad和Bax蛋白表达,下调ERK细胞保护通路并上调JNK应激相关通路,最终协同抑制HL60/ADR细胞增殖并诱导其凋亡。     

Inhibition of IRAK1/4 sensitizes T cell acute lymphoblastic leukemia to chemotherapies

Signaling via the MyD88/IRAK pathway in T cells is indispensable for cell survival; however, it is not known whether this pathway functions in the progression of T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Here, we determined that compared with thymic and peripheral T cells, T-ALL cells from patients have elevated levels of IRAK1 and IRAK4 mRNA as well as increased total and phosphorylated protein. Targeted inhibition of IRAK1 and IRAK4, either with shRNA or with a pharmacological IRAK1/4 inhibitor, dramatically impeded proliferation of T-ALL cells isolated from patients and T-ALL cells in a murine leukemia model; however, IRAK1/4 inhibition had little effect on cell death. We screened several hundred FDA-approved compounds and identified a set of drugs that had enhanced cytotoxic activity when combined with IRAK inhibition. Administration of an IRAK1/4 inhibitor or IRAK knockdown in combination with either ABT-737 or vincristine markedly reduced leukemia burden in mice and prolonged survival. IRAK1/4 signaling activated the E3 ubiquitin ligase TRAF6, increasing K63-linked ubiquitination and enhancing stability of the antiapoptotic protein MCL1; therefore, IRAK inhibition reduced MCL1 stability and sensitized T-ALL to combination therapy. These studies demonstrate that IRAK1/4 signaling promotes T-ALL progression through stabilization of MCL1 and suggest that impeding this pathway has potential as a therapeutic strategy to enhance chemotherapeutic efficacy.