我国不同艾滋病候选疫苗小鼠细胞免疫应答评价

目的 比较我国不同艾滋病(AIDS)候选疫苗小鼠细胞免疫应答水平.方法 将我国6种艾滋病候选疫苗按其各自免疫程序,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞,利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)与胞内因子染色法(ICS)检测其对HIV特异多肽的细胞免疫应答水平.结果 6种艾滋病候选疫苗利用潜在T细胞表位(PTE)Gag、Env和Pol肽库和ELISPOT法检测IFN-γ的分泌情况,结果各疫苗的小鼠细胞免疫阳转率为70%～100%,各疫苗引起特异细胞免疫应答的反应肽库不同,强度亦不相同.1#和2#疫苗利用ELISPOT检测分泌Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2的小鼠脾细胞数量,两疫苗的IFN-γ和IL-2检测结果均呈中度相关性(r1=0.62,P1＜0.01;r2=0.79,P2＜0.01).ELISPOT和ICS检测1#疫苗免疫后分泌IFN-γ的小鼠脾细胞数,结果两种方法的小鼠阳转率均为66.7%(10/15),ELISPOT阳性细胞数与ICS阳性细胞比例呈中度相关(r=0.55,P＜0.05).结论 我国不同AIDS候选疫苗引起的小鼠细胞免疫应答在广度和强度上存在差别.ELISPOT或ICS检测IFN-γ等Th1类细胞因子可作为疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的评价指标.     

灭活与减毒两种甲肝疫苗免疫后诱导细胞免疫应答初探

目的 对国内普遍应用的减毒和灭活甲肝疫苗诱导的细胞免疫水平(产生时间、应答水平)进行检测和比较.方法 筛选健康志愿者18人,随机分组后分别接种甲肝减毒活疫苗和甲肝灭活疫苗.按实验程序以周次为时间点采血,用化学发光法对特异性甲肝抗体(HAY-IgG)进行检测;同时收集外周血单个核细胞(PBMC),用特异性甲肝抗原刺激后,以酶联免疫斑点试验(ELISPOT)法检测效应T细胞分泌TH1型细胞因子IFN-γ的情况;用胞内细胞因子染色法测定CD+ T和CD8+T淋巴细胞中分泌IFN-γ的阳性细胞百分比,Lumlnex法检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4等多种细胞因子水平.结果 两种疫苗均可诱导产生特异性抗HAV抗体,且观测期间抗体水平差异无统计学意义.两种疫苗接种初期即可诱导产生病毒特异性T细胞免疫应答反应,同时伴随高水平的效应细胞因子IFN-γ产生.在免疫接种后1-3周,灭活疫苗诱导的细胞免疫应答水平高于减毒疫苗;而在4-6周,减毒疫苗诱导的细胞免疫应答水平明显增高,超过灭活疫苗.灭活疫苗所诱导的细胞免疫应答在加强免疫后明显增强.结论 两种疫苗接种初期均可诱导体液和细胞免疫应答;灭活疫苗加强免疫后可激发记忆性免疫应答.     

塞姆利基森林病毒翻译增强序列对HIV Gag DNA疫苗抗原表达和免疫原性的调节

目的 研究塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）衣壳蛋白5’翻译增强区对基于该病毒复制子的HIV Gag DNA疫苗抗原表达水平和免疫原性的影响：方法将SFV衣壳蛋白（capsid，C蛋白）基因的5’端102bp翻译增强区插入到SFT复制子DNA疫苗载体pCMV-Rep的SFV亚基因启动子下游，得到DNA疫苗载体pCMV-RepC。将删除ATG的HIV-1 gag基因插入pCMV-RepC，使gag编码区与翻详增强区融合，得到DNA疫苗质粒pCMV-RepC-gag。同时，构建携带未融合翻译增强序列的DNA疫苗质粒pCMV-Rep-gag。Western blot检测翻译增强序列对Gag表达水平的影响。用上述两种DNA疫苗分别免疫BALB／c雌性小鼠，ELISA检测Gag特片的抗体反应，ELISPOT和细胞内因子染色技术检测细胞免疫应答。结果衣壳蛋白5’翻译增强区增强了Gag表达水平，对体液免疫应答没有显著影响，但显著增强了特异性细胞免疫应答水平。结论SFVC蛋白翻译增强区能显著提高SFV复制子DNA疫苗的抗原表达和抗原特异性细胞免疫反心。     

注射用布氏菌活疫苗免疫学评价

目的以小鼠为动物模型,通过检测布氏菌活疫苗免疫小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及保护力,对其进行免疫学评价。方法将30只小鼠随机分为3组,皮下免疫布氏活疫苗,免疫4周后分离血清及脾脏淋巴细胞。ELISA法检测免疫动物血清中总IgG抗体,抗体亚类IgG1及IgG2a;ELISPOT法检测分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目,以及用ELISA方法检测体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4的细胞因子水平;用羊布氏菌弱毒株M5攻击免疫动物,通过脾脏细菌计数评价布氏活疫苗的免疫保护作用。结果用ELISA法检测到免疫布氏活苗的小鼠体内有特异性抗体产生;ELISPOT可检测到较高的分泌IFN-γ脾脏淋巴细胞数目,ELISA方法可检测到较高的IFN-γ水平,表明布氏活疫苗主要诱导Th1型免疫应答;通过布氏活疫苗保护力分析,表明该疫苗具有较好的免疫保护效果。结论布氏疫苗采用注射免疫途径是可行的,免疫后能获得较好的免疫效果。     

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用。     

表达HIV-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗免疫原性比较

目的 在小鼠体内比较表达HIT-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗的免疫原性.方法 分别用rAAV2/1-gag或rAd5-gag单独免疫BALB/c小鼠一次或两次,于免疫后不同时间点用CFSE染色法和胞内细胞因子染色法检测Gag特异性细胞免疫应答,用ELISA方法检测Gag特异性抗体反应.结果 单次免疫结果显示,在所有检测点rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答都比rAAV2/1-gag强,抗体反应在免疫后4周无明显差异.两次免疫后4周的检测结果表明,rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答比rAAV2/1-gag强,但抗体反应比rAAV2/1-gag组弱.结论 rAd5-gag诱导了很好的HIV-1特异性细胞和抗体反应,而rAAV2/1-gag诱导的HIV-1特异性抗体反应很强,但细胞免疫应答较弱.     

肺癌抗原COX-2长肽疫苗的设计及免疫活性检测

目的:设计针对肺癌抗原环加氧酶2(COX-2)的长肽,并鉴定这些长肽的免疫活性。方法:通过Net CTL 1. 2、SYFPEITHI和IEDB软件预测打分来选取COX-2的HLA-A2限制性表位;对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位集中区域选取合适长度的长肽,通过体外活性实验验证长肽是否具有免疫活性。树突状细胞(DC)荷肽实验和ELISPOT检测荷长肽DC诱导的外周血单个核细胞(PBMCs)中干扰素γ(IFN-γ)的释放;胞内因子染色检测表位肽诱导CTL的能力;乳酸脱氢酶(LDH)实验和CFSE法检测CTL对靶细胞的杀伤活性。结果:ELISPOT和胞内因子染色实验结果显示,长肽P315-338和P375-401诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力。CFSE和LDH细胞毒实验结果显示表位P315-338和P375-401对靶细胞有一定的杀伤作用。结论:成功筛选并鉴定出针对肺癌抗原COX-2的2条长肽。这2条长肽具有用作免疫治疗疫苗的潜能。     

胰腺癌高表达抗原MUC4 CTL表位肽的体内免疫原性

目的:检测来源于黏蛋白4(MUC4)的人白细胞抗原(HLA)-A2限制性表位肽免疫BALB/c小鼠后产生细胞免疫应答的水平,筛选出体内具有免疫原性的HLA-A2限制性表位肽。方法:将来源于MUC4的候选HLA-A2限制性表位肽、通用性Th表位和弗氏不完全佐剂联合应用皮下免疫BALB/c小鼠,用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠脾细胞表位肽特异性细胞免疫应答的水平,体内细胞毒实验活性检测候选肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的能力,并用流式细胞术检测表位肽特异性的CD8+T细胞所占比例。结果:在检测的4个表位肽中,P2004-1Y9V诱导BALB/c小鼠产生的细胞免疫应答最强,细胞毒实验结果显示,P2004和P2004-1Y9V对CAPAN-2细胞均有一定的杀伤作用,且P2004-1Y9V特异性CTLs对CAPAN-2细胞杀伤率高于原肽(P0.05)。胞内因子染色实验进一步表明P2004-1Y9V免疫后可产生特异性的CD8~+T细胞。结论:在来源于MUC4的HLA-A2限制性表位肽中,P2004-1Y9V具有较强的体内免疫原性,可以作为潜在的肿瘤多肽疫苗应用于临床研究。     

含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用

目的研究含信号肽MTB8.4基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用。方法雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即含信号肽的MTB8.4(MS)基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1 组和PBS组。ELISA检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,观察小鼠部分肺和脾组织的病变程度;Z-N染色查结核杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用。结果MS基因疫苗能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;免疫组小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。结论结核病MS基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护作用,但尚需进一步提高。     

HCVE2-gAD融合DNA疫苗的构建及其细胞免疫效果评价

目的 将丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）包膜糖蛋白E_2与脂联素球部结构域（gAD）进行基因融合后构建DNA疫苗,并通过免疫小鼠评价其所诱发的HCV E_2特异性细胞免疫应答.方法 根据E_2与gAD的基因序列设计引物,分别扩增出不含跨膜区的E_2基因和添加连接肽的gAD基因,再利用重叠PCR将二者融合,以pVRC为载体构建DNA疫苗质粒,经体外转染293T细胞并用Western Blot证实其表达后,采用皮内注射加卡钳电极电转的方式于0、3、6周免疫BALB/c小鼠,取脾细胞进行ELISPOT检测分析其所诱发的E_2特异性T细胞免疫应答水平.结果 成功构建了能有效表达E_2-gAD融合蛋白的新型DNA疫苗,经皮内电转方式免疫小鼠后可获得比单独E_2疫苗更强的HCV特异性T细胞免疫应答.结论 gAD基因的融入可在一定程度上增强疫苗的免疫原性,为新型HCV DNA疫苗的进一步发展和优化莫定基础.     

携带EBV-LMP2基因的重组MVA痘苗病毒初步免疫效果

目的 观察携带EBV lmp2基因的重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内诱导的LMP2特异性细胞免疫应答效果.方法 使用表达EBV lmp2基因的重组痘苗病毒MVA-Lac-LMP2,采用低（2＆#215;105 pfu/只）、中（2 ＆#215; 106pfu/只）、高（2 ＆#215; 107pfu/只）三个剂量组,分别于0、2周免疫BALB/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γ ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV LMP2特异性CTL应答水平.结果 MVA-Lac-LMP2能诱导小鼠产生EBV LMP2特异性的CTL应答,其中,中、高剂量组小鼠CTL水平明显高于低剂量组（P≤0.01）,中、高剂量组小鼠诱导的CTL应答水平差异没有统计学意义.结论 MVA-Lac-LMP2能够在小鼠体内诱导EBV-LMP2特异性的细胞免疫,应答水平的高低与免疫剂量有关.     

HIVpol基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的 了解pol基因修饰前后在不同载体系统中表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Pol靶抗原奠定实验基础.方法 将含有优化前后pol基因的HIV-1DNA( pVRC)疫苗和痘苗病毒载体(rVV)疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN -γ ELISPOT和ICS检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Pol诱发的免疫效果.结果 DNA疫苗中pol基因修饰后细胞免疫反应由112提高至258 (SFC/106SMNC),抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由101.7提高至102.3,三针后则没有差别;而以痘苗病毒为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应( ～600SFC/106SMNC)和抗体水平(～102.2)均没有差异.两种疫苗联合免疫均可显著提高Pol在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由788提高至2500( SFC/106 SMNC),抗体水平则没有差别.结论 Pol基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对重组痘苗病毒疫苗单独免疫效果无明显影响.     

Ad-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内免疫效果的研究

目的观察带有EBV-LMP2的非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗免疫恒河猴诱导的针对EBV-LMP2的特异性细胞和体液免疫应答。方法分别使用高剂量(4·5×1011VP/kg)、中剂量(1·5×1011VP/kg)、低剂量(0·5×1011VP/kg)三个剂量的Ad-LMP2重组腺病毒,肌内注射免疫恒河猴,每5d免疫一次,共免疫6次,第7周时使用ELISPOT方法检测猴外周血细胞毒性T细胞应答,同时应用免疫酶方法检测血清中抗LMP2抗体。结果3个剂量免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答,免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系,较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的要高。抗腺病毒中和抗体和抗LMP2抗体免疫2周后就可以检测到,其中抗LMP2抗体在免疫3~4周时滴度较高,7周时则与3~4周时接近或有所下降。结论非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV-LMP2特异性细胞和体液免疫反应。     

Evaluation of a needle-free delivery platform for prime-boost immunization with DNA and modified vaccinia virus ankara vectors expressing herpes simplex virus 2 glycoprotein D

A previous report described a prime-boost immunization strategy using plasmid and modified vaccinia virus Ankara (MVA) vectors expressing herpes simplex virus 2 glycoprotein D (gD). Enhanced humoral and cellular immune responses were elicited by the prime-boost combination compared to plasmid DNA immunization alone. Surprisingly, a more diverse antibody isotype response, and a greater antibody and cellular immune response, was obtained if the gD MVA vector was used as the priming immunization rather than the gD plasmid vector. The present report evaluates the use of a needle-free delivery platform (Biojector) for delivery of plasmid and MVA gD-expressing vectors in a prime-boost immunization strategy. Needle-free delivery of both plasmid and MVA gD expression vectors was efficient, reproducible, and elicited a strong immune response in immunized mice. Biojector delivery of plasmid DNA was able to evoke a broader isotype response and cellular immune response than that obtained by gene gun delivered plasmid DNA. Further, DNA priming by Biojector delivery as part of a prime-boost procedure with MVA-gD2 resulted in a diverse antibody isotype distribution and enhanced cellular immune responses, similar to the responses obtained when MVA-gD2 was used as the priming immunization. Thus, needle-free delivery of plasmid DNA may provide additional flexibility and options for effective prime-boost vaccination.     

Evaluation of a self-inactivating lentiviral vector expressing simian immunodeficiency virus gag for induction of specific immune responses in vitro and in vivo

Humoral and cellular immune responses have been shown to play a fundamental role in controlling simian and/or simian-human immunodeficiency virus (SIV-SHIV) replication in infected macaques. Therefore, the appropriate induction of both compartments of the immune system should be elicited after immunization. In this context, viral vectors have been proven effective in inducing both humoral and cellular immune responses during immunization protocols after direct injection in vivo. Among them, recombinant self-inactivating lentiviral vectors represent a useful strategy for vaccine development because they efficiently transduce and express foreign genes into a wide variety of mammalian cells. Here we report on the development and evaluation of a self-inactivating HIV-based lentiviral vector expressing a codon-optimized SIV Gag sequence (TY2-SIVGagDX), which when used to transduce dendritic cells mediated in vitro expansion of Gag-specific T cells derived from an SHIV-infected cynomolgus monkey, as measured by interferon (IFN)-gamma enzyme-linked immunospot (ELISPOT) and (51)Cr release standard assays. To evaluate the ability to elicit specific immune responses in vivo, TY2-SIVGagDX was also employed in a vaccination protocol after a single intramuscular injection in BALB/c mice. Results indicated that the vector was able to efficiently induce both cellular and humoral responses, as measured by IFN-gamma ELISPOT assay and antibody production. These data further confirm that lentiviral vectors encoding viral genes represent an advantageous delivery system for vaccine development.     

DNA/MVA HIV-1/AIDS vaccine elicits long-lived vaccinia virus-specific immunity and confers protection against a lethal monkeypox challenge

Modified vaccinia Ankara (MVA) is being tested in humans as an alternative to the current smallpox vaccine Dryvax. Here, we compare the magnitude and longevity of protective immune responses elicited by a DNA/MVA HIV-1 vaccine with those elicited by Dryvax using a monkeypox virus/macaque model. The DNA/MVA vaccine elicited similar levels of vaccinia virus (VV)-specific antibody and 5-10-fold lower levels of VV-specific cellular responses than Dryvax. This MVA-elicited cellular and humoral immunity was long-lived. A subset of the DNA/MVA- and Dryvax-vaccinated macaques were subjected to a lethal monkeypox virus challenge at 3 years after vaccination. All of the vaccinated monkeys survived, whereas the unvaccinated controls succumbed to monkeypox. The viral control correlated with early postchallenge levels of monkeypox-specific neutralizing antibody but not with VV-specific cellular immune response. Thus, our results demonstrate the elicitation of long lasting protective immunity for a lethal monkeypox challenge by a DNA/MVA HIV-1 vaccine.     

含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价

目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达;成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

一种IFN-γ ELISPOT检测方法的建立

目的:建立检测一种融合蛋白疫苗诱导特异性细胞免疫的ELISPOT实验方法,通过分析免疫小鼠分泌IFN-γ的水平,评价疫苗诱导的细胞免疫应答效应.方法:以融合蛋白疫苗免疫C57BL/6小鼠,14天后加强免疫一次,于第28天无菌取脾,分离脾淋巴细胞,计数并调整细胞浓度,在已包被好的ELISPOT板中分别加入细胞悬液和刺激肽进行刺激培养.裂解细胞,依次加入酶标二抗、底物、显色液,在ELISPOT读板仪进行斑点计数和分析.结果:ELISPOT检测结果与动物免疫途径、细胞培养时间、细胞密度、肽浓度等条件密切相关.实验结果证明:采用皮下注射的免疫途径,免疫效果最佳;小鼠脾淋巴细胞浓度为4×105个/孔,加入1 μg/孔的刺激肽刺激培养24～48小时的条件下,产生的特异性斑点数最多,本底干扰小,有利于结果判断.结论:实验建立了IFN-γ ELISPOT检测方法,可用于该融合蛋白疫苗细胞免疫研究.