α-粒子诱发BEP2D细胞癌变系的DNA断裂重接修复缺陷与XRCCs修复基因mRNA表达研究

目的 研究α粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)癌变细胞系BERP35T-1和BERP35T-4的DNA断裂损伤修复能力,分析其DNA断裂修复基因XRCCs系列的mRNA表达。方法 脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂,RT-PCR分析DNA修复基因的mRNA表达。结果 恶性转化细胞系BERP35T-1和BERP35T-4受0～150Gyγ射线照射后修复4h的DNA断裂残留损伤显着高于亲本BEP2D细胞,mRNA表达分析显示修复基因XRCC2、XRCC3和Ku80(XRCC5)表达下调2.5～6.5倍,而BERP35T4细胞中DNAPKcs(XRCC7)表达上调2.4倍。结论 α粒子诱发恶性转化细胞系的DNA链断裂修复机理缺陷,其中部分原因是DNA修复基因的表达抑制。DNA修复缺陷将导致细胞基因组不稳定性,α粒子诱发细胞恶性转化机理可能与此相关。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中脂质和DNA氧化损伤的研究

目的 探讨α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化的机制.方法 运用DCFH-DA荧光探针标记活性氧(ROS),观察分析BEP2D细胞、α粒子作用BEP2D后第22代细胞RH22,以及α粒子作用BEP2D后恶性转化细胞株BERP35T-１内基础活性氧水平.丙二醛(MDA)测定试剂盒检测BEP2D、RH22和BERP35T-1细胞内脂质过氧化产物丙二醛的含量.采用免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,检测BEP2D、α粒子作用BEP2D后第23代细胞RH23及BERP35T-1细胞内DNA氧化损伤产物8-OH-dG和DNA双链断裂产物γ-H2AX的表达水平.结果 与BEP2D细胞相比,RH22和BERP35T-1细胞中基础活性氧水平显著升高(t=4.30和3.94,P＜0.05),丙二醛的含量显著升高(t=4.89和15.10,P＜0.05);RH23和BERP35T-1细胞中8-OH-dG表达上调(t=3.80和2.92,P＜0.05),γ-H2AX表达上调(t=7.61和12.67,P＜0.05).结论 氧化还原环境紊乱形成氧化压力,导致细胞内脂质和DNA氧化损伤增强,由此促进基因组不稳定性,可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化的机制之一.     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达microRNAs的筛选

目的 筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的microRNAs。方法 用microRNAs芯片筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的microRNAs。结果 与 BEP2D细胞相比,R15H20细胞中存在38个差异表达microRNAs,其中18个表达上调,20个表达下调;与 BEP2D细胞相比,RHT35细胞中存在87个差异表达microRNAs,其中47个表达上调,40个表达下调;与 R15H20细胞相比,RHT35细胞中存在38个差异表达microRNAs,其中20个表达上调,18个表达下调;与 BEP2D细胞相比,R15H20和RHT35细胞中变化一致的microRNAs有25个,其中10个表达上调,15个表达下调。结论 microRNAs表达异常与α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化密切相关。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中抗氧化能力和辐射敏感性研究

目的 研究α粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化中细胞的抗氧化能力和辐射敏感性变化.方法 运用谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)试剂盒分别检测永生化人支气管上皮细胞BEP2D、α粒子作用BEP2D后第21代细胞RH21和α粒子作用BEP2D细胞后形成的恶性转化细胞BERP35T-1内抗氧化酶GPX和CAT的活性以及抗氧化剂GSH的含量;四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测0、30、60、90、120和150 μmol/L H2O2作用BEP2D、RH21和BERP35T-1细胞96 h后,细胞增殖率的差异;0、2、4和8 Gy γ射线照射BEP2D、RH21和BERP35T-1细胞7～9 d后,用细胞克隆计数和MTT法检测细胞增殖率和存活分数的变化.结果 RH21和BERP35T-1细胞中GPX酶活力均低于BEP2D细胞(t=5.75和7.65,P＜0.05).BEP2D细胞中CAT酶活力是RH21细胞的2.64倍,是BERP35T-1细胞的5.76倍.RH21细胞中GSH含量与BEP2D细胞比较,差异无统计学意义;恶性转化细胞BERP35T-1内GSH含量则明显低于BEP2D细胞(t=7.76,P＜0.05).与BEP2D细胞相比,60、90、120和150 μmol/L H2O2作用后RH21细胞的增殖率降低(t=29.90～84.68,P＜0.01),30、60、90、120和150 μmol/L H2O2作用后BERP35T-1细胞的增殖率降低(t=10.37～58.36,P＜0.01).4和8 Gy γ射线照射后,RH21细胞的增殖率和存活分数均显著低于BEP2D细胞(t=6.33～45.00,P＜0.05);2、4和8 Gy γ射线照射后,BERP35T-1细胞的增殖率和存活分数较BEP2D细胞明显降低(t=5.87～34.17,P＜0.05).结论 α粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化过程中,细胞的抗氧化能力降低、辐射敏感性增强.抗氧化系统功能减弱可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化和辐射敏感性增强的机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the antioxidant ability and radiosensitivity in the malignant transformed human bronchial epithelial cell line BEP2D induced by α-particle exposure.Methods Glutathione Peroxidase (GPX),Catalase (CAT) and Glutathione (GSH) assay kits were employed to detect GPX and CAT enzyme abilities and the levels of GSH in BEP2D,RH21 ( passage 21 of α-particle-irradiated BEP2D cells),and BERP35T-1 cells (derived from nude mice bearing malignant transformed cells generated from cells of passage 35 of α-particle-irradiated BEP2D cells).MTT assay were used to test the growth rate of BEP2D,RH21 and BERP35T-1 cells treated with 0,30,60,90,120,and 150 μmoL/L H2O2.Colony-forming test and MTT assay were used to examine the cell survival fraction and the growth rate of BEP2D,RH21 and BERP35T-1 cells exposed to 0,2,4,and 8 Gy of γ-rays,respectively.Results GPX and CAT enzyme activities in RH21 and BERP35T-1 cells were obviously lower than in BEP2D( t = 5.75-67.92 ,P ＜ 0.05 ).CAT enzyme activity in BERP35T-1 was lower than that in RH21 cells (t =22.25 ,P ＜0.01 ).Compared to BEP2D cells,decreased level of GSH was detected in BERP35T-1 cells(t = 7.76,P ＜ 0.05 ),but there was no change in RH21.After treatment with 30,60,90,120,and 150 μmol/L H2O2,the growth rates of BEP2D were all higher than those of BERP35T-1 cells(t = 10.37-58.36,P ＜0.01 ).Meanwhile,the growth rates of BEP2D were all higher than those of RH21 cells after treatment with 60,90,120,and 150 μ mol/L H2O2 (t = 29.90-84.68,P ＜ 0.01 ).In addition,compared to BEP2D cells,decreased cell survival fraction and growth rate of BERP35T-1 cells were observed after irradiation with 2,4,and 8 Gy of y-rays ( t = 5.87-34.17,P ＜ 0.05 ).The cell survival fraction and growth rate of RH21 were all lower than those of BEP2D cells at 4 and 8 Gy post-irradition( t =6.33- 45.00,P ＜ 0.05 ).Conclusion The function of antioxidant system decreased in the α-particleinduced transformed cells,which could contribute to the acceleration of cellular malignant transforming process and radiosensitivity.     

α粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D癌变克隆的细胞遗传学分析

目的 :分析α_粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化细胞克隆的核型 ,探讨辐射致癌的细胞遗传学变化规律。方法 :1.5Gyα粒子照射BEP2D细胞恶性转化后进行亚克隆 ,用G带显示法分析亚克隆细胞核型。结果 :分析了 5个恶性转化亚克隆细胞 (BERP35T_1,_2 ,_4 ,_5 ,_6 ) ,基本核型与亲本细胞BEP2D相近 ,但有着明显的染色体缺失差异。BERP35T癌变细胞系缺失 1条 13号染色体和Y染色体 ;1条 2号染色体的长臂增加 ;缺失正常的12号染色体 ,出现 1条长臂增加的 12号染色体。此外 ,2株癌变细胞 (BERP35T_2和BERP35T_4 )多倍体高达 4 0 % ,明显高于BEP2D细胞。结论 :染色体缺失 (尤其是 13号染色体缺失 )是辐射致癌的一个显著遗传学特点 ,2号和 12号染色体长臂增加可能导致某些肿瘤相关基因的扩增或激活 ,促进细胞的恶性转化。     

α—粒子诱发BEP2D2细胞癌变系的DNA断裂重接修复缺陷与XRCCs修复基因mRNA表达研究

目的 研究α粒子诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）癌变细胞系BERP35T－1和BERP35T－4的DNA断裂损伤修复能力，分析其DNA断裂修复基因XRCCs系列的mRNA表达。方法 脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂，RT－PCR分析DNA修复基因的mRNA表达。结果 恶笥转化细胞系BERP35T－1和BERP35T－4受0－150Gy γ射线照射后修复4h的DNA断裂残留损伤显著高于亲本BEP2D细胞，mRNA表达分析显示修复基因XRCC2，XRCC3和Ku80(XRCC5)表达下调2.5-6.5倍，而BERP355－R细胞中DNA－PKcs(XRCC7)表达上调2．4倍。结论 α粒子诱发恶性转化细胞系的DNA链断裂修复机理缺陷，其中部分原因是DNA修复基因的表达抑制。DNA修复缺陷将导致细胞基因组不稳定性，α粒子诱发细胞恶性转化机理可能与此相关。     

MTAP在人BEP2D细胞辐射致癌模型和肺癌中表达研究

目的探索甲硫腺苷磷酸化酶(Methyhhioadenosine Phosphorylase，MTAP)在人支气管上皮BEP2D永生化细胞的恶性转化过程和临床非小细胞肺癌中的表达变化。方法培养BEP2D和BERP35T-2细胞，制备细胞总蛋白，进行双相电泳和质谱分析；选择有表达差异的蛋白质点MTAP，在细胞模型中进行NorthernBlot分析；对获得的15例肺癌标本用RT—PGR方法分析验证MTAP的表达水平。结果双相电泳发现MTAP在恶性转化细胞BERP35T-2中表达降低；Northern Blot分析表明MTAP mRNA在BEP2D永生化细胞中表达水平很高，而在BERP35T-2恶转细胞中表达极低；对15例非小细胞肺癌进行RT-PCR分析，发现MTAP在73．3％(11／15)的肿瘤组织中低表达；在中／低分化组肺癌的低表达频率(90．9％)显著高于高分化组(25％)，在腺癌与鳞癌组则没有显著性差异。结论MTAP低表达现象与肺癌恶性转化密切相关，可能发挥抑癌基因的生物学功能。     

α粒子诱发癌变细胞的纺锤体损伤凋亡机理研究

目的　从纺锤体损伤诱导的凋亡反应 ,探讨α粒子诱发癌变细胞的遗传不稳定性机理。方法　用噻氨酯哒唑破坏纺锤体微管蛋白诱发细胞凋亡 ,Giemsa染色以及 3种荧光染料 (FDA、Hoechster 332 5 8和PI )复合染色检测凋亡 ;松胞素B阻止细胞分裂 ,分析凋亡与细胞周期时相的关系。结果　 0 3μg ml噻氨酯哒唑作用 6～ 4 8h ,癌变细胞BERP35T1和BERP35T4的凋亡发生率要显著低于正常BEP2D细胞 2～ 2 5倍 (P <0 0 1) ,而且正常细胞的凋亡主要是发生在细胞有丝分裂前 ,癌变细胞特别是BERP35T4细胞 ,有近 5 0 %的凋亡是发生在有丝分裂之后。结论　纺锤体损伤后凋亡机理异常 ,将导致非整倍体或多倍体的子代细胞增多 ,加剧α粒子照射细胞的遗传不稳定性。     

γ射线照射BEP2D细胞诱导表达的外泌体miRNA的鉴定和功能生物信息学分析

目的 识别鉴定γ射线照射细胞外泌体中放射诱导表达的miRNA分子,为揭示放射损伤旁效应机制提供新的线索。方法 ⁶⁰Co γ射线照射人支气管上皮细胞BEP2D,超高速离心法分别从2 Gy照射细胞和对照细胞的培养液上清中收集外泌体,用电子显微镜鉴定外泌体,miRNA芯片杂交检测分析外泌体中miRNA表达谱,qRT-PCR方法验证部分miRNA的表达变化,通过TargetScan、miRanda、GO和KEGG等生物信息学技术分析预测靶基因及其相关功能通路。结果BEP2D细胞2 Gy照射后4 h的外泌体中miRNA表达与对照组相比,共鉴定了16个表达水平显著上调的miRNA分子（P<0.05）,对其中miR-100-5p、miR-1246、miR-29b-3p、miR-7-5p在外泌体中表达上调通过定量RT-PCR得到进一步的验证。同时,还分析了上述4个miRNA在受照细胞内的表达变化,结果显示除miR-7-5p外其余3个miRNA分子在照射后2 h表达上升,4 h时后均显著降低,而此时外泌体中相应miRNA的表达是显著增加的。生物信息学分析结果表明,这些miRNA可能通过调控细胞粘附、蛋白磷酸化修饰、mTOR信号通路、染色质修饰以及DNA损伤的HR和NHEJ修复等信号通路来参与细胞辐射旁效应过程。结论 鉴定了辐射诱导BEP2D细胞外泌体中差异表达miRNAs分子,这些miRNA的靶基因参与细胞重要的生物学过程和功能信号通路,为揭示辐射诱导旁效应的机制提供了新的线索。     

3D打印模板联合CT引导125I粒子植入治疗骨转移癌术前术后剂量学评价

目的 对比分析3D打印模板联合CT引导¹²⁵I粒子植入治疗骨转移癌术前术后常用剂量学指标差异,指导临床应用。方法 对2019年6月至2021年1月天津市第三中心医院骨转移癌粒子植入手术的10例患者共12个病灶进行回顾性分析,12个病灶均采用3D打印模板引导粒子植入,处方剂量120~140 Gy,比较术前治疗计划及术后验证计划中常用剂量学指标差异,包括D₉₀、D₁₀₀、V₉₀、V₁₀₀、V₁₅₀以及术前计划粒子数量和术后实际使用粒子数量,采用配对t检验对术前术后剂量参数进行对比分析。结果 术前和术后D₉₀、D₁₀₀、V₉₀、V₁₀₀、V₁₅₀等剂量学指标差异均无统计学意义（P>0.05）,术后实际使用粒子数量多于术前计划,差异有统计学意义（t=-2.930,P<0.05）。结论 3D打印模板联合CT引导¹²⁵I粒子植入治疗骨转移癌,剂量精准,可达到术前计划要求,应积极推广临床使用。     

3D打印个体化非共面模板辅助粒子植入时定位与复位误差研究

目的 探讨3D打印个体化非共面模板（简称3D模板）辅助放射性¹²⁵I粒子植入治疗中定位和复位时的误差。方法 选取2015—2016年收治的41例3D模板辅助粒子植入治疗患者。术前2日行CT扫描模拟定位。根据肿瘤靶区位置、深度的图像信息行3D模板针道设计、打印模板。术前3D模板复位,对术前定位计划3D模板位置和复位时3D模板位置的x轴（左右）、y轴（头脚）进行对比分析,并对不同部位、体位3D模板复位与术前摆位误差进行分析。结果 头颈部、胸部和盆腔粒子植入术前计划3D模板定位x、y轴与复位时3D模板位置平均绝对误差分别为（1.77±1.09）、（2.66±1.65）、（4.00±1.41）、（5.22±1.85）、（1.88±1.29）和（2.52±1.37）mm。与胸部相比,头颈部和盆腔部的x和y轴方向位置误差差异有统计学意义（t=-3.730、-3.080、-3.944、-4.519,P<0.05）;其余结果差异无统计学意义（P>0.05）。结论 3D模板辅助放射性粒子植入联合CT模拟定位技术对模板定位、复位具有很好的校正作用,误差小、精度高,值得临床普及和推广。     

miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中作用的研究

目的 研究miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中的作用及其机制。方法 实时定量聚合酶链反应检测Raji细胞miR-155的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测PTEN和p-AKT的表达。结果 miR-155 RNA和p-AKT蛋白在Raji细胞中表达较高,而pten基因mRNA和蛋白质表达水平极低,单纯4.0 Gy照射48 h后Raji细胞凋亡率较低;miR-155 siRNA不仅使miR-155 RNA和p-AKT表达水平明显下降,而且pten基因mRNA和蛋白质水平显著增高,同时细胞显示出增殖抑制作用,显著增加Raji细胞对该辐射剂量敏感性,siRNA+射线照射组细胞凋亡率为(36.78±1.35)%,高于单纯照射组(t=12.572,P<0.05)。结论 miR-155 表达对Raji细胞辐射敏感性具有重要影响,其机制与PTEN/PI3K/AKT信号途径激活有关。     

辐射暴露后HIF-1α介导的胰腺外分泌细胞能量代谢变化研究

目的 阐明胰腺外分泌细胞辐射损伤后线粒体损伤情况、能量代谢变化及其可能机制。方法 大鼠胰腺外分泌细胞AR42 J分为照射组与空白对照组,照射组予单次6 Gy X射线照射,空白对照组未做处理。分别检测24、48、72、96 h线粒体膜电位,24及48 h三磷酸腺苷（ATP）产生量、乳酸产生量,24 h活性氧（ROS）产生量;行免疫印迹试验检测辐照后24 h应激及能量代谢相关因子HIF-1α、LDHA、PDH表达情况。大鼠按照随机数表法分为照射组和对照组。对照组给予12 Gy X射线照射,对照组予假照射（0 Gy）,每组4只。实验结果经动物体内实验进一步验证。结果 与对照组相比,照射组细胞在接受辐照后24~96 h,线粒体膜电位呈进行性下降（t=5.438~17.687,P<0.05）,24及48 h ATP产生量下降（q=17.300、8.328,P<0.05）,乳酸产生量升高（q=21.790、16.250,P<0.05）,24 h ROS产生量升高（t=7.935,P<0.05）;辐照促使缺氧诱导因子HIF-1α表达显著升高,介导糖酵解的关键因子LDHA显著升高,PDH表达下调,应用小干扰RNA技术沉默HIF-1α表达在一定程度上消除了辐照诱导的上述蛋白表达的变化。这些结果得到动物体内实验的验证。结论 胰腺外分泌细胞在电离辐射应激下,通过上调HIF-1α表达,促使能量代谢方式发生转变,糖酵解途径加强,而经线粒体的有氧氧化受到抑制。     

125I粒子和60Co γ射线照射对A549及BEAS-2B细胞生物学效应的影响

目的 探讨¹²⁵I粒子和⁶⁰Co γ射线对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞和正常支气管上皮BEAS-2B细胞生物学效应的影响。方法 A549、BEAS-2B细胞均行¹²⁵I粒子和⁶⁰Co γ射线不同剂量照射;集落形成实验检测细胞存活分数;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果 A549细胞在4、6、8 Gy照射时,¹²⁵I粒子组细胞克隆存活分数较⁶⁰Co组降低更明显(t=6.06、9.42、4.90,P<0.05)。A549细胞在4 Gy时,G₁期细胞比例¹²⁵I粒子组为70.67%±1.49%,⁶⁰Co组为59.59%±0.71%(t=10.77,P<0.05);细胞凋亡率¹²⁵I粒子组为18.09%±0.73%,⁶⁰Co组为9.81%±0.16%(t=19.40,P<0.05)。¹²⁵I粒子照射明显上调Bax、cleaved Caspase-3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达。但不同射线同一剂量或相同射线不同剂量下,BEAS-2B细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白的表达无明显变化。结论 ¹²⁵I粒子持续低剂量率照射较⁶⁰Co γ射线高剂量率照射抑制A549细胞增殖的效应更明显。Bcl-2/Bax蛋白比失衡,最终致Caspase-3蛋白的活化在¹²⁵I粒子持续低剂量率照射抑制肿瘤细胞增殖的效应中可能发挥重要的作用。     

Musashi1基因表达对人结肠癌HCT116细胞的放射增敏作用及其机制

目的 研究沉默Musashi1对人结肠癌HCT116细胞放射敏感性的影响,为放射治疗提供新的增敏靶点。方法 用慢病毒载体建立Musashil（Msi1）低表达的稳转细胞株及阴性对照细胞株,将细胞分为沉默组、空白对照组和阴性对照组,通过克隆实验、流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞周期,证实其放射敏感性。结果 成功构建了沉默Musashi1的HCT116细胞。沉默组的D₀、D_q、N、SF₂分别为1.55、0.88、1.76 Gy和0.43,空白对照组分别为2.17、1.51、2.01 Gy和0.64,阴性对照组分别为1.99、1.45、2.07 Gy和0.62。沉默组相对于空白对照组的放射增敏比为1.40,相对于阴性对照组的放射增敏比为1.28。8 Gy照射后24、48、72 h,沉默组凋亡比例始终高于阴性对照组和空白对照组（F=65.16,P<0.05）,而阴性对照组和空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。12 Gy照射后48 h,沉默组细胞周期中G₂/M期比例较空白对照组和阴性对照组显著下降（F=65.398,P<0.05）。结论 降低Musashi1的表达对人结肠癌HCT116细胞有放射增敏作用,可能通过促进其凋亡,解除G₂/M期阻滞而发挥放射增敏作用,有望成为新的增敏靶点。     

lncRNA CCAT1靶向miR-130b-3p对人胰腺癌细胞PANC-1放射敏感性的影响

目的 探讨lncRNA CCAT1和miR-130b-3p对体外培养的胰腺癌细胞PANC-1放射敏感性的影响。方法 采用Real-time PCR检测胰腺癌组织及其细胞系和2 Gy X射线照射后PANC-1细胞中CCAT1和miR-130b-3p的相对表达水平。沉默CCAT1表达、抑制miR-130b-3p表达后,应用流式细胞仪、Caspase 3活性检测试剂盒及克隆形成实验检测细胞凋亡率、Caspase 3活性和细胞存活分数,并绘制单击多靶模型拟合曲线;利用starBase v2.0在线预测、荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀实验（RIP）及Real-time PCR实验,验证CCAT1和miR-130b-3p的靶向关系。结果 在放射抵抗的胰腺癌组织、胰腺癌细胞系和2 Gy照射的PANC-1细胞中,CCAT1表达均上调（t=6.322~8.555,P<0.05）,miR-130b-3p表达下调（t=3.950~18.795,P<0.05）。2 Gy照射并沉默CCAT1,PANC-1细胞存活分数降低（t=2.929、5.047、5.234、5.125,P<0.05）,细胞凋亡率增加（t=6.953,P<0.05）,Caspase 3活性升高（t=6.836,P<0.05）。发现CCAT1能靶向调控miR-130b-3p表达,抑制miR-130b-3p表达,PANC-1细胞存活分数增大（t=4.564、6.736、8.656,P<0.05）,细胞凋亡减少（t=5.234,P<0.05）,Caspase 3活性降低（t=10.440,P<0.05）。结论 沉默CCAT1表达能够促进miR-130b-3p表达,从而增加PANC-1细胞放射敏感性。     

沉默细胞周期检测点激酶1(Chk1)对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

目的 探讨siRNA沉默细胞周期检测点激酶1（Chk1）基因对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法 合成Chk1基因的小分子干扰RNA（si-Chk1）,将si-NC或者si-Chk1分别转染到宫颈癌HeLa细胞中,0、2、4、6、8、10 Gy剂量的X射线照射细胞,RT-qPCR和Western blot检测转染后Chk1的mRNA水平和蛋白水平的表达,MTT方法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡,克隆形成实验检测转染后HeLa细胞放射敏感性,Western blot检测转染后P21蛋白和抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达水平。结果 si-Chk1转染到HeLa细胞后,HeLa细胞Chk1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（t=2.12~5.86,P<0.05）,沉默Chk1的表达抑制了宫颈癌HeLa细胞的增殖（t=3.15~6.36,P<0.05）,同时降低宫颈癌HeLa细胞克隆形成能力（t=1.58~6.36,P<0.05）,上调P21（t=4.35,P<0.05）、下调Bcl-2蛋白（t=2.37,P<0.05）的表达水平。结论 siRNA沉默Chk1表达能够增强HeLa细胞放射敏感性。     

放射性125I粒子植入对人肺腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的影响

目的 探讨放射性¹²⁵I粒子植入对人肺腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的影响及其作用机制。方法 制备人肺腺癌细胞A549裸鼠皮下移植瘤模型24只,采用随机数字表法分为4组,每组6只,0、22.2、29.6 MBq组和对照组。用18 G植入针在各组裸鼠瘤体内分别植入放射活度为0、22.2和29.6 MBq ¹²⁵I粒子,每个移植瘤内植入一枚,对照组不予处理。观察肿瘤生长情况,每4天测量肿瘤大小。30 d后处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线。瘤组织免疫组织化学S-P法检测微血管密度（microvascular density,MVD）,并分别用RT-PCR、Western blot法检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的mRNA及蛋白的表达。结果 粒子植入治疗后54 d,22.2、29.6 MBq组移植瘤体积明显小于对照组（q=14.117、17.075,P<0.05）,但0 MBq组与对照组、22.2与29.6 MBq组瘤体积差异均无统计学意义（P>0.05）。CD34阳性染色结果显示,22.2 MBq组的MVD为522±119,29.6 MBq组为491±121,明显低于对照组的922±260（q=4.826、5.197,P<0.05）,但0 MBq组与对照组、22.2 MBq组与29.6 MBq组差异均无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR检测表明,22.2 MBq组的VEGF和HIF-1α mRNA相对表达量分别为0.279±0.0659和0.370±0.0857,29.6 MBq组为0.215±0.0620、0.278±0.0651,均低于对照组（q=18.881、17.211和15.376、14.733,P<0.05）,但0 MBq组与对照组、22.2 MBq组与29.6 MBq组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示,22.2 MBq组与29.6 MBq组瘤组织VEGF和HIF-1α蛋白表达均明显减少,与对照组相比,差异有统计学意义（q=5.848、6.263和6.560、7.576,P<0.05）,但0 MBq组与对照组以及22.2 MBq组与29.6 MBq组差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 放射性¹²⁵I粒子植入能有效抑制人肺腺癌裸鼠移植瘤微血管生成。     

抑制FOXD1基因表达增强结直肠癌细胞HCT116的放射敏感性

目的 研究抑制FOXD1基因的表达对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测人结直肠癌组织和细胞中FOXD1 mRNA和蛋白的表达。对结直肠癌HCT116细胞行梯度剂量（0、2、4、6 Gy）X射线照射,qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中FOXD1的表达。将siRNA阴性对照和FOXD1 siRNA转染至结直肠癌细胞中,分别记为si-NC组和si-FOXD1组,经4 Gy的X射线照射处理后记为si-NC+4 Gy组和si-FOXD1+4 Gy组,Western blot检测各组细胞中FOXD1的表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的增殖活性,克隆形成实验检测各组细胞存活率,采用TECT DNA-PK试剂盒检测各组细胞中DNA-PK活性,将转染的结直肠癌细胞接种于BALB/c裸鼠建立移植瘤模型,进行射线照射后,检测各组肿瘤的体积和质量变化。结果 与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中FOXD1 mRNA和蛋白的表达均显著增加（t=5.579、4.816,P<0.05）,与结肠黏膜上皮细胞NCM460相比,结直肠癌细胞株中FOXD1 mRNA（t=5.85~17.62,P<0.05）和蛋白（t=9.04~11.42,P<0.05）表达均显著升高。结直肠癌细胞HCT116中FOXD1的表达量随着放射剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,差异有统计学意义（t=9.13~44.15,P<0.05）。转染si-FOXD1能够有效地抑制结直肠癌细胞中FOXD1的表达（t=10.51,P<0.05）,FOXD1敲低后能够抑制结直肠癌细胞的增殖活性（t=10.41,P<0.05）,提高结直肠癌细胞的放射敏感性,放射增敏比为1.797,降低放射诱导的DNA-PK的活性（t=6.20,P<0.05）。抑制FOXD1的表达经射线照射后,裸鼠种植瘤体积和重量明显减小（t=11.29、3.69,P<0.05）。结论 抑制FOXD1基因的表达能够提高结直肠癌细胞的放射敏感性,抑制结直肠癌裸鼠移植瘤的生长,可为改善放射治疗对结直肠癌患者的治疗效果提供潜在的靶向基因。     

LncRNA CRNDE靶向miR-384影响结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的 研究长链非编码RNA （Lnc RNA）结直肠肿瘤差异表达基因（CRNDE）对结直肠癌细胞放射敏感性的影响及其机制。方法 以结直肠癌HT-29细胞作为体外研究对象,转染CRNDE shRNA,实时定量PCR测定干扰效果。以8 Gy X射线照射转染CRNDE shRNA后的HT-29细胞,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡水平。平板克隆实验检测放射敏感性。生物信息学软件预测CRNDE与miR-384有互补结合位点,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将CRNDE shRNA和miR-384 inhibitor共转染至HT-29细胞中,以8 Gy剂量照射处理,MTT和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡变化。结果 CRNDE shRNA能够降低HT-29细胞中CRNDE表达水平（1.00±0.08 vs. 0.42±0.06,t=10.051,P<0.05）。CRNDE shRNA和放射均可以抑制HT-29细胞增殖并诱导细胞凋亡,并且二者联合具有协同作用[凋亡率：（2.27±0.13）%、（23.58±2.35）%、（26.91±2.81）%、（36.84±3.24）%,F=24.66,P<0.05;吸光度（A）值：0.45±0.06、0.30±0.02、0.28±0.03、0.20±0.02,F=106.21,P<0.05]。CRNDE shRNA转染后可以提高HT-29细胞放射敏感性,放射增敏比为1.374。CRNDE靶向负调控miR-384表达。miR-384 inhibitor能够拮抗CRNDE shRNA对放射处理的结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进的作用。结论 下调LncRNA CRNDE表达可增强结直肠癌细胞的放射敏感性,其作用机制与靶向负调控miR-384表达有关。