无机三氧化物聚合物盖髓材料对成牙本质样细胞的毒性

背景：无机三氧化物聚合物是一种优良的盖髓材料,它对原代培养成牙本质细胞的细胞毒性研究较少。目的：通过与氢氧化钙制剂比较,检测无机三氧化物聚合物对小鼠原代培养成牙本质样细胞的细胞毒性。方法：取19d龄胎鼠的下颌第一磨牙牙胚,分离牙乳头组织,用组织块培养法培养;然后用滤纸片法挑选出与成牙本质细胞形态接近的细胞继续培养,对挑选出的细胞从形态学观察及牙本质涎磷蛋白在mRNA水平上的表达方面进行鉴定。将培养出的成牙本质样细胞与含有无机三氧化物聚合物或氢氧化钙制剂的DMEM培养基或空白DMEM培养基共同培养2,4,6d后,通过CCK-8技术检测体外培养成牙本质样细胞的毒性。结果与结论：镜下观察培养的细胞呈梭形、长三角形或梨形,有单侧较长突起,并特异性表达牙本质涎磷蛋白。细胞毒性方面,无机三氧化物聚合物组随培养时间延长,细胞数目逐渐增多（P〈0.05）,细胞增殖良好;氢氧化钙制剂组细胞增殖情况显著低于空白对照组（P〈0.05）。提示与氢氧化钙制剂相比,无机三氧化物聚合物对成牙本质样细胞有较小的细胞毒性,具有良好的生物相容性。     

纳米羟基磷灰石和氢氧化钙对成牙本质细胞活性影响的比较

背景:将纳米羟基磷灰石与成牙本质细胞共同培养能更直观反映羟基磷灰石作为齿科盖髓材料的细胞相容性,但体外培养成牙本质细胞较困难。目的:观察纳米羟基磷灰石和氢氧化钙对小鼠成牙本质细胞的活性的影响。方法:取胎鼠下颌第一磨牙牙胚,采用组织块培养法对小鼠牙乳头细胞进行原代培养,倒置显微镜下挑选具有成牙本质样细胞形态的细胞观察细胞形态及生长情况。采用RT-PCR法对细胞牙本质涎磷蛋白的表达进行鉴定,确定为成牙本质样细胞。取对数生长期的第4代成牙本质样细胞,分别用含有100mg/L纳米羟磷灰石和100mg/L氢氧化钙的培养基培养1,3,5,7天,并设置空白对照组。结果与结论:CCK-8法检测结果显示,培养1,3,5,7d,纳米羟基磷灰石组的细胞生长良好。培养3,5,7d,氢氧化钙组细胞活性低于空白对照组(P<0.01)。碱性磷酸酶测定法检测结果显示,羟基磷灰石和氢氧化钙均对碱性磷酸酶活性无明显影响。结果证实,纳米羟基磷灰石对成牙本质细胞活性无影响,氢氧化钙对其细胞活性有抑制作用。     

纳米羟基磷灰石和氢氧化钙对成牙本质细胞活性影响的比较

背景：将纳米羟基磷灰石与成牙本质细胞共同培养能更直观反映羟基磷灰石作为齿科盖髓材料的细胞相容性,但体外培养成牙本质细胞较困难。目的：观察纳米羟基磷灰石和氢氧化钙对小鼠成牙本质细胞的活性的影响。方法：取胎鼠下颌第一磨牙牙胚,采用组织块培养法对小鼠牙乳头细胞进行原代培养,倒置显微镜下挑选具有成牙本质样细胞形态的细胞观察细胞形态及生长情况。采用RT-PCR法对细胞牙本质涎磷蛋白的表达进行鉴定,确定为成牙本质样细胞。取对数生长期的第4代成牙本质样细胞,分别用含有100mg/L纳米羟磷灰石和100mg/L氢氧化钙的培养基培养1,3,5,7天,并设置空白对照组。结果与结论：CCK-8法检测结果显示,培养1,3,5,7d,纳米羟基磷灰石组的细胞生长良好。培养3,5,7d,氢氧化钙组细胞活性低于空白对照组（P〈0.01）。碱性磷酸酶测定法检测结果显示,羟基磷灰石和氢氧化钙均对碱性磷酸酶活性无明显影响。结果证实,纳米羟基磷灰石对成牙本质细胞活性无影响,氢氧化钙对其细胞活性有抑制作用。     

人乳牙牙髓基质细胞的分离培养与牙再生能力

背景:在牙组织工程和牙再生的研究中,寻找合适的种子细胞是当前的中心和热点.目的:分离培养儿童乳牙牙髓基质细胞,比较研究矿化诱导前后牙本质涎磷蛋白表达的差异.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-12/2007-12在大庆油田总医院中心实验室完成.对象:选择8～10岁儿童8名,男4名,女4名,排除传染病及内分泌疾病史,乳牙排除牙体牙髓牙周疾病.牙髓取材于颌外门诊拔除的滞留乳磨牙.方法:通过组织块贴壁法获得乳牙牙髓基质细胞,并在含体积分数10%胎生血清的DMEM培养基中原代培养14 d,消化传代后用添加有10-8 mol/L地塞米松,50 μmol/L左旋抗坏血酸,10 nmol/L维生素D3,10 mmol/L β-磷酸甘油钠的DMEM/F12培养基诱导培养14 d,用不含添加成分的完全DMEM培养基培养作对照.主要观察指标:显微镜下观察细胞形态变化和生长规律.免疫细胞化学染色比较诱导前后牙本质涎磷蛋白的表达差异.结果:乳牙牙髓基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,经矿化诱导14 d后多数细胞由梭形转变成多角形和柱型,胞核大而圆,B0%以卜细胞的细胞质牙本质涎磷蛋白表达阳性.而未经诱导的细胞仍为梭形,仅有2%的细胞牙本质涎磷蛋白染色呈阳性.结论:乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养后具有向成牙本质细胞分化的潜能,可以尝试作为牙再生研究新的种子细胞来源.     

人类牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向的诱导分化

目的:探讨人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制和分化过程。方法:实验于2004-04/2005-03在四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。①实验材料:选择四川大学华西第二医院自然流产的三四个月胎龄的人胚胎(孕妇知情同意,经过医院伦理委员会批准),胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子(均购自美国Sigma公司)。②实验分组:实验分为空白对照组、胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子组和联合组。③实验干预:在建立人牙乳头间充质细胞体外培养模型的基础上,用不含白血病抑制因子的DMEM/F12培养基作为基础培养液,分别用浓度为10μg/L的胰岛素样生长因子Ⅰ、浓度为100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子以及同时用这两种因子诱导人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向分化。④实验评估:采用倒置显微镜、免疫细胞化学和反转录-聚合酶链反应等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果:①培养和诱导细胞形态学变化及碱性磷酸酶活性:诱导细胞培养7d时,联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组的培养细胞均呈现单一胞浆突起,形态上出现成牙本质样细胞改变,细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,联合组细胞的胞浆突起更明显,细胞的碱性磷酸酶活性更高;碱性成纤维细胞生长因子组与对照组比较,细胞变化不明显。②细胞免疫化学结果:联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组牙本质涎磷蛋白的免疫细胞化学染色胞浆呈阳性。③细胞hDSPPmRNA的表达:联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组细胞经反转录-聚合酶链反应后获得约599bp的特异性片段,表明两组细胞在mRNA水平表达特异性牙本质涎磷蛋白。而其余两组未见表达。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ能刺激人牙乳头间充质细胞向功能性成牙本质细胞样细胞分化,碱性成纤维细胞生长因子可产生协同作用。     

转化生长因子β3诱导人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞的分化

背景：转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用目前仍有待研究。目的：探讨转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的作用。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得人乳牙牙髓干细胞;对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞单独加入25μg/L重组转化生长因子β3、10 U/mL肝素,或者二者联合进行培养;通过Q-PCR和Western-blotting方法,分别检测乳牙牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白基因及牙本质涎蛋白表达的情况;通过碱性磷酸酶试剂盒检测乳牙牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论：乳牙牙髓干细胞在诱导体系中生长状态良好。25μg/L转化生长因子β3＋10 U/mL肝素联合作用组的碱性磷酸酶活性明显增强,与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异有显著性意义（P〈0.01）;转化生长因子β3＋肝素联合作用组的茜素红染色呈强阳性,Q-PCR和Western-blotting结果均显示,转化生长因子β3＋肝素联合作用组的牙本质涎磷蛋白mRNA和蛋白表达均明显升高。结果可见在转化生长因子β3与肝素联合作用的诱导下,可促进乳牙牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞。     

猪牙乳头细胞与β-磷酸三钙支架构建牙髓牙本质复合体样结构

目的:牙乳头细胞是牙髓细胞、牙本质细胞的前体细胞,应用组织工程方法探讨以猪牙乳头细胞为种子细胞构建牙髓牙本质复合体的可行性. 方法:实验于2004-03/2005-11在上海市口腔医学重点实验室完成.以第1代猪牙乳头细胞为种子细胞与β-磷酸三钙为支架材料复合后接种在裸鼠皮下.移植在裸鼠皮下的β-磷酸三钙支架与牙乳头细胞复合物为实验组,同期移植牙胚作为阳性对照组,同期植入的空白β-磷酸三钙支架材料作阴性对照组.每组3个样本,在同一裸鼠皮下植入.8周后取材进行组织学(苏木精-伊红染色及Goldner'三色法染色)、牙本质涎蛋白免疫组织化学及透射电镜检测.结果:①移植物组织学切片显示在支架材料孔隙内形成了牙髓牙本质复合体样结构,由牙本质基质样物质、前期牙本质样物质及牙髓样组织组成.在牙本质样物质内部可见少量牙本质小管,牙髓样组织外层细胞较为密集且单层排列,表现出成牙本质细胞样细胞的特征.②免疫组织化学染色显示,在邻近成牙本质细胞样细胞周围的前期牙本质内牙本质涎蛋白呈阳性表达.③透射电镜结果显示,实验组局部可见牙本质小管样结构.结论:以猪牙乳头细胞为种子细胞、β-磷酸三钙为支架材料,成功构建出牙髓牙本质复合体样结构.     

成纤维细胞条件培养基对雪旺细胞生长和增殖的影响

目的:观察成纤维细胞条件培养基对雪旺细胞增殖分化的影响,探讨两者之间的协同作用,为组织工程化神经桥接体的构建奠定实践基础。方法:取20只出生四五天的SD乳鼠的臂丛和坐骨神经,运用双酶结合单酶消化法培养雪旺细胞和成纤维细胞,纯化和培养雪旺细胞并制备两种条件培养基:A组:成纤维细胞+DMEM/F12;B组:成纤维细胞+雪旺细胞+DMEM/F12;C组:DMEM/F12(对照组)。将A,B,C3组分别加入种植有纯化雪旺细胞的96孔板中,MTT检测雪旺细胞增殖情况,S-100蛋白免疫组化染色鉴定雪旺细胞。结果:B组对雪旺细胞的增殖和分化有明显的促进作用;A组次之;C组最差(P<0.001)。结论:成纤维细胞条件培养基可促进雪旺细胞的增殖和分化。     

胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响

背景:研究表明,胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对细胞的增殖分化有重要作用,但对人类牙乳头间充质细胞生物学特性有何影响尚不清楚.目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人类牙乳头间充质细胞增殖和分化能力的影响.方法:在建立人类牙乳头间充质细胞培养模型的基础上,①分别用含体积分数为1%或10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将两种生长因子配制成不同的实验终浓度,取第4代生长良好的人类牙乳头间充质细胞,分别加入含0,0.1,1,10,100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和0,25,50,75,100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ的培养基(0 μg/L作对照),培养96 h后四甲基偶氮唑盐法测增殖活性.②设10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组、100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组和对照组.同上述方法每孔分别加含相应质量浓度生长因子的培养液,分别在培养1,3,5,7 d后,四甲基偶氮唑盐法测细胞增殖活性,改良酶动力学法测定细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:在0～100 μg/L质量浓度范围时,两种生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖具有促进作用,碱性成纤维细胞生长因子的促增殖作用比胰岛素样生长因子Ⅰ大,联合作用时有协同促增殖作用.碱性成纤维细胞生长因子的最大有效质量浓度为10 μg/L,胰岛素样生长因子Ⅰ的最大作用质量浓度为100 μg/L.在0～7 d时,碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞的碱性磷酸酶活性影响不明显,随时间的增加,胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞碱性磷酸酶活性影响增加,与碱性成纤维细胞生长因子联用时,对增加碱性磷酸酶的活性有协同作用.     

人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化

目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系。方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成。利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7d,绘制生长曲线。第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力。结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞。②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性。③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低。结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型。     

Dentin matrix protein 1 induces cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts

Odontoblasts are postmitotic cells that differentiate from the dental papilla. These cells are responsible for producing the calcified dentin matrix. The pulp-odontoblast interphase contains undifferentiated mesenchymal stem cells, which have the ability to cytodifferentiate into odontoblast-like cells in response to specific signaling molecules. Dentin matrix protein 1 (DMP1) is one of the dentin noncollagenous extracellular matrix proteins that has been implicated in regulation of mineralization. In this study, we have examined the potential role of DMP1 in inducing cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblast-like cells and formation of reparative dentin in a rat model. Cavities were drilled and pulps exposed in maxillary first molars. Collagen matrix impregnated with recombinant DMP1 was implanted directly in Group 1, while calcium hydroxide, a commonly used pulp-capping agent was implanted in group 2, collagen matrix that was not impregnated with rDMP1 was implanted directly in group 3, which served as control. Each of these three groups was subdivided into two subgroups, A for 2 weeks time duration and B for 4 weeks duration. At the end of the time period the maxillae were excised, tissues were processed for histological and immunohistochemical evaluations. The results showed that DMP1 could act as a morphogen on undifferentiated mesenchymal cells present in the dentin-pulp complex. These differentiated cells had the potential to regenerate dentin-like tissue, which was confirmed by the presence of collagenous matrix, odontoblast specific markers and calcified deposits.     

不同浓度骨碎补提取液对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响

背景:体外培养人牙髓细胞难度很大,国内外已有生长因子对体外培养牙髓细胞增殖分化作用的研究,而中药骨碎补对体外培养牙髓细胞的影响,经作者检索未见报道.目的:观察不同浓度骨碎补提取液对体外培养的人牙髓细胞增殖分化的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在河北医科大学第四医院科研中心完成.材料:人牙髓细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求正畸治疗需拔除的健康阻生智齿着,取得所有供者对标本采集的知情同意.产地云南的骨碎补购自河北医科大学第四医院中药房.方法:采用组织块法体外培养人牙髓细胞.水提醇沉法提取骨碎补有效成分,以每1 mL药液含生药1 g加入积体分数为0.02的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,50,100,500,1 000 mg/L.分别以此培养液作用于体外培养的人牙髓细胞,以不加骨碎补提取液培养的细胞做对照.主要观察指标:①人牙髓细胞原代培养和来源鉴定.②四甲基偶氮唑盐法检测各质量浓度组骨碎补对人牙髓细胞增殖的作用.③免疫组织化学法观察各浓度组骨碎补对人牙髓细胞纤维连接蛋白的表达.④扫描电镜和透射电镜下观察骨碎补对人牙髓细胞超微结构的影响.结果:原代培养的人牙髓细胞呈梭形或多角形.各浓度骨碎补均对体外培养的人牙髓细胞有促增殖作用,其中以100 mg/L浓度组促增殖作用最明显,可诱导牙髓细胞合成、分泌纤维连接蛋白.电镜下实验组人牙髓细胞表面枝状嵴丰富,细胞周围可见细胞外基质,细胞浆内有丰富粗面内质网和游离的核糖体,核内常染色质均匀分散,异染色质少.结论:含1 00 mg/L骨碎补培养液对体外培养的人牙髓细胞有明显的促增殖作用.     

新型抗菌不锈钢微螺钉种植体的细胞毒性分析

背景:降低不锈钢微螺钉种植体的脱落率,开发新型的抗菌材料,可以从根本上预防种植体周围炎的发生.目的:通过体外细胞培养法评价新型抗菌不锈钢种植体的细胞毒性.方法:将待检试件(抗菌不锈钢、医用不锈钢、医用纯钛)制备成15 mm×10 mm×3 mm的长方体,表面逐级抛光后,无水乙醇脱脂、超声清洗并行高温高压消毒.将各试件以3 cm~2/mL的比例浸泡于DMEM高糖培养基中置于37℃温箱内96 h,微孔滤膜过滤除菌.实验设0.64%的苯酚培养液作为阳性对照组及空白DMEM培养基阴性对照组.倒置相差显微镜观察MG63细胞在各试件浸提液中的生长情况,通过MTT实验得出细胞在培养24,48,72,96,120 h后的吸光度值,并计算其相对增殖率评价抗菌不锈钢的细胞毒性.结果与结论:①培养24 h,阳性对照组细胞形态异常呈空泡状、其余各组细胞贴壁生长良好.②培养48 h后,随着作用时间的延长,阳性对照组细胞表现出明显的中毒形态,其余各组细胞生长旺盛,医用不锈钢及抗菌不锈钢组开始出现少量细胞核固缩.③3组试件吸光度值由高到低依次为医用纯钛、抗菌不锈钢、医用不锈钢,但3者之间差异无显著性意义.④在观察期医用纯钛组、医用不锈钢组、抗菌不锈钢组细胞毒性等级均为0级.结果表明抗菌不锈钢毒性等级与医用不锈钢和医用纯钛相同,符合口腔正畸材料的临床应用要求.     

Stimulation of reparative dentin formation by ex vivo gene therapy using dental pulp stem cells electrotransfected with growth/differentiation factor 11 (Gdf11)

Dental pulp progenitor/stem cells have the capacity to differentiate into odontoblasts and they provide a potential for dentin repair and regeneration by gene therapy. To develop a successful ex vivo gene therapy to induce reparative dentin formation rapidly and effectively after treatment of caries, we developed a three-dimensional pellet culture system of pulp cells electrotransfected with growth/differentiation factor 11 (Gdf11). The viability after electrotransfection was more than 85%, and the efficiency was about 70% as determined by flow cytometry. After 10 days of culture, the total amount of type I and type III collagen was 3-fold higher in the pEGFP-Gdf11-transfected pellet than in the control. Real-time RT-PCR analysis demonstrated that the expression of markers of odontoblast differentiation (alkaline phosphatase, dentin matrix protein 1 [Dmp1], dentin sialophosphoprotein [Dspp], enamelysin, and phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on X-chromosome [Phex]) was increased in the pEGFP-Gdf11-transfected pellet compared with the control on day 14. On the basis of this in vitro evaluation, an in vivo investigation in the dog was performed. Autogenous transplantation of Gdf11-transfected cells cultured as a pellet on amputated pulp stimulated reparative dentin formation. Thus, Gdf11 gene therapy may be potentially used in endodontic treatment in dentistry.     

中药骨碎补对人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞体外增殖的实验研究

目的探讨中药骨碎补对体外培养的人的牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法采用组织块法外培养人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞,取第4、5代培养细胞随机分为实验组和对照组,实验组加不同浓度的骨碎补,对照组只加培养液。通过HE染色观察其对牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞的形态、结构及生长增殖的影响,通过MTT法和考马斯亮蓝法对实验组和对照组的细胞生长情况和总蛋白合成的检测。结果 1在10~1000μg/ml浓度范围内骨碎补对人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞均有促增殖作用(P0.05),尤以100μg/ml浓度最为明显(P0.01);2总蛋白测定结果显示在骨碎补浓度为10μg/ml时,对照组与其总蛋白含量差异无统计学意义(P0.05),实验组细胞总蛋白含量随骨碎补浓度增加高于对照组(P0.05),尤以500μg/ml骨碎补浓度组作用牙髓成纤维细胞最佳;而100μg/ml骨碎补浓度组作用牙龈、牙周膜成纤维细胞最显著。结论骨碎补在有效作用浓度范围内,其促增殖效应和总蛋白含量与骨碎补浓度呈剂量依赖关系,随着浓度的增加促增殖作用增强、总蛋白含量增加,浓度达到最大作用后,随着浓度增加作用反而呈现减弱趋势。