不同浓度5-氮胞苷体外诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：在体外将人脐带间充质干细胞诱导为心肌样细胞的5-氮胞苷合适浓度的研究较少,且无明确结论。目的：对比不同浓度5-氮胞苷诱导人脐带间充质干细胞转化为心肌细胞的效果,以确定一种合适的诱导浓度。方法：第2代人脐带间充质干细胞中分别加入浓度为2.5,5,10,20,40,80μmol/L的5-氮胞苷,作用24h后除去,继续培养4周。于诱导后第2周行免疫组化染色检测肌钙蛋白Ⅰ阳性细胞率。结果与结论：5-氮胞苷诱导后7d,细胞形态发生变化,细胞多紧密平行排列生长,细胞体积变大,梭形细胞比例下降,40,80μmol/L组细胞形态变化明显。4周时,40,80μmol/L组细胞的折光性减低,细胞活性减弱,继续出现死亡的细胞。诱导后2周,2.5μmol/L组肌钙蛋白Ⅰ染色为阴性,10,20,40,80μmol/L组细胞肌钙蛋白Ⅰ阳性率均明显高于5μmol/L组（P〈0.05）。提示5-氮胞苷可诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞转化,10μmol/L是较佳的诱导浓度。     

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa是传统中医药治疗心肌缺血的有效成分,是否可参与骨髓间充质于细胞向心肌样细胞分化的过程呢？目的：观察黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化作用的影响。方法：应用M丌法分别测定黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa的最大无毒浓度,确定两者联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的剂量。将分离纯化的骨髓间充质干细胞分5组进行诱导：黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa组、丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、5-氮胞苷组、空白对照组,ELISA方法观察体外诱导后骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43和肌钙蛋白表达变化。结果与结论：诱导后丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷、5-氮胞苷组肌钙蛋白、缝隙连接蛋白43表达水平均高于正常对照组（P〈0．01）,丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组高于丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷组（P〈0。01）。丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组与5-氮胞苷组缝隙连接蛋白43表达水平差异无显著性意义（P〉0．05）。结果提示黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞方向转化,而其联合作用高于单一成分的作用。     

参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的干预

目的:用药物预适应方法进行干细胞诱导已有报道,本实验观察中药参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化中的作用。方法:实验于2003-01/05在南京医科大学药理教研室完成。①实验材料:清洁级SD大鼠8只。参三七皂苷Rg18mg,批号20021017,由云南省长春花生物制剂公司提供,加入不含胎牛血清的IMDM培养液10mL,调配成10-4mol/L溶液,4℃保存。5-氮胞苷(Sigma公司,批号021209)。②实验方法:贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。设立4组:空白对照组常规培养后进行无血清处理,每3d换液1次;5-氮胞苷单用组单纯以10μmol/L的5-氮胞苷进行处理,其终浓度为1×10-8moL/L,连续诱导15d;5-氮胞苷 参三七皂苷Rg1预适应组分别加入0.1,1μmol/L参三七皂苷Rg1培养液处理24h,再各以10μmol/L的5-氮胞苷进行诱导,其终浓度为1×10-8moL/L,连续诱导15d。③实验评估:取第2代骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线并计算群体倍增时间。观察诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化。激光共聚焦显微镜测定细胞表面积变化和细胞内钙离子浓度。结果:①5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化:骨髓间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,在突起末端出现分支,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。其超微结构呈梭形,有明显的肌丝,细胞核呈单椭圆形,位于细胞中央,间质干细胞形似心肌细胞。②参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖特性的影响:与5-氮胞苷单用组比较,5-氮胞苷 参三七皂苷Rg1预适应组从第3天开始细胞数明显增加,细胞生长曲线均无明显的生长平台期,达到高峰后细胞数开始减少。③参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积的影响:与空白对照组骨髓间充质干细胞表面积比较,5-氮胞苷单用组明显降低,0.1,1μmol/L参三七皂苷Rg1预适应则能显著升高5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积(P<0.01)。④参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞内游离钙水平的影响:与空白对照组比较,5-氮胞苷诱导4周后骨髓间充质干细胞内游离Ca2 相对荧光强度均明显升高(t=6.72,P<0.01),且5-氮胞苷 1μmol/L参三七皂苷Rg1预适应组升高幅度大于5-氮胞苷单用组(t=3.13,P<0.05)。结论:①参三七皂苷Rg1预适应在体外可显著刺激5-氮胞苷诱导的鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化和增殖,改善细胞形态,刺激细胞内钙离子增加。②参三七皂苷Rg1与5-氮胞苷对骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化产生协同效应。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加（P〈0.05）。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

不同浓度5-氮胞苷体外诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:在体外将人脐带间充质干细胞诱导为心肌样细胞的5-氮胞苷合适浓度的研究较少,且无明确结论。目的:对比不同浓度5-氮胞苷诱导人脐带间充质干细胞转化为心肌细胞的效果,以确定一种合适的诱导浓度。方法:第2代人脐带间充质干细胞中分别加入浓度为2.5,5,10,20,40,80μmol/L的5-氮胞苷,作用24h后除去,继续培养4周。于诱导后第2周行免疫组化染色检测肌钙蛋白Ⅰ阳性细胞率。结果与结论:5-氮胞苷诱导后7d,细胞形态发生变化,细胞多紧密平行排列生长,细胞体积变大,梭形细胞比例下降,40,80μmol/L组细胞形态变化明显。4周时,40,80μmol/L组细胞的折光性减低,细胞活性减弱,继续出现死亡的细胞。诱导后2周,2.5μmol/L组肌钙蛋白Ⅰ染色为阴性,10,20,40,80μmol/L组细胞肌钙蛋白Ⅰ阳性率均明显高于5μmol/L组(P<0.05)。提示5-氮胞苷可诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞转化,10μmol/L是较佳的诱导浓度。     

人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的特异性基因表达

背景：脐带来源的间充质干细胞进行自体心肌内移植,修复损伤心肌组织,是心血管研究领域的热点。目的：应用5-氮胞苷诱导人脐带间充质干细胞转化为心肌样细胞后进行鉴定,以确定心肌样细胞的结构、形态和功能。方法：分离培养人脐带间充质干细胞,在第2代细胞中分别加入浓度为2.5,5,10,20,40,80μmol/L 的5-氮胞苷,作用24 h 后除去,继续培养4周。结果与结论：5-氮胞苷诱导前,无细丝样结构、无颗粒,胞浆量均匀且少,核/浆比例高,细胞形态呈现典型的梭形,细胞呈漩祸样或同心圆生长,核内会见到较为明显的核仁;在5-氮胞苷处理24 h 之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol/L 组细胞形态变化明显。反转录-聚合酶反应检测2.5,40μmol/L 组诱导4周,5,10,20μmol/L 组诱导1,2,3,4周时人脐带间充质干细胞心钠素、α-骨骼肌动蛋白基因表达呈阳性。提示经5-氮胞苷诱导的人脐带间充质干细胞表达心肌细胞的特定基因。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的:以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法:采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论:诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P<0.05)。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达

背景：人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,经诱导后是否可向心肌细胞分化？目前的报道尚不多。目的：观察人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后肌钙蛋白I的表达情况。方法：取第2代人脐带间充质干细胞标本,经消化、离心、沉淀后,分为7份,制成细胞悬液,调整细胞浓度为2×10^7L^-1,分别加入浓度为80,40,20,10,5,2．5,0μmol／L5-氮胞苷于同样条件继续培养,作用24h后除去,继续培养4周。结果与结论：①人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷处理24h之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol／L组细胞形态变化明显。②免疫组化染色显示5,10,20,40,80μmol／L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性,对照组与2．5μmol／L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性。选取5个高倍视野进行细胞计数,80,40,20,10μmol／L组间心肌样细胞的转化率差异无显著性意义,均明显高于5μmol／L组（P〈0．05）。⑨超微结构观察显示经5-氮胞苷诱导后4周时部分人脐带间充质干细胞内可见典型的肌小节及心房颗粒。而未经5-氮胞苷诱导的对照组无以上改变。结果提示经5-氮胞苷诱导后人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞转化。     

碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用比较

目的:对比观察碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用。方法:实验于2005-12/2006-07在中山大学干细胞与组织工程中心实验室进行。实验材料:清洁级大鼠由中山大学实验动物中心提供(SCXR(粤)2004-0011,粤监证字2004A089),三四周,大约50g。实验方法:①分离培养大鼠骨髓间质干细胞,并采用流式细胞仪鉴定。②取第3代骨髓间质干细胞,以1×107L-1接种于24孔培养板和六孔板中,24h后换液并分组:对照组:仅仅更换培养液;5-氮胞苷诱导组:10μmol/L5-氮胞苷孵育24h后更换新鲜培养液;5-氮胞苷 碱性成纤维生长因子诱导组:10μmol/L5-氮胞苷孵育24h后更换含10μg/L碱性成纤维生长因子的新鲜培养液;5-氮胞苷 转化生长因子β1诱导组:10μmol/L5-氮胞苷孵育24h后更换含10μg/L转化生长因子β1的新鲜培养液。以后每3d换液1次,前2组换完全培养基,后2组分别换含10μg/L碱性成纤维生长因子和10μg/L转化生长因子β1的完全培养基。③30d后应用RT-PCR法检测心肌细胞转录因子GATA-4、结蛋白表达,免疫细胞化学染色法检测细胞心肌肌钙蛋白,并在倒置显微镜下观察细胞跳动情况。结果:①骨髓间质干细胞的生长特性及鉴定:原代培养大鼠骨髓质干细胞3d后镜下可见有细胞贴壁,形成克隆,七八天长满,随着换液和传代,细胞逐渐纯化,第3代细胞形成均一的长梭形,流式细胞仪检测发现CD44、CD29表达阳性,CD45、CD11b表达阴性。②骨髓间质干细胞向心肌细胞的分化:大鼠骨髓间质干细胞经5-氮胞苷、5-氮胞苷 碱性成纤维生长因子或5-氮胞苷 转化生长因子β1诱导30d后,有部分细胞心肌肌钙蛋白表达阳性,GATA-4和结蛋白表达明显增强。镜下观察5-氮胞苷 碱性成纤维生长因子诱导组所诱导细胞变细、胞体伸长,呈心肌样细胞跳动,并较其他两组明显,心肌肌钙蛋白阳性细胞的比率较高(P<0.05)。结论:碱性成纤维生长因子在体外有协同5-氮胞苷促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用,而转化生长因子β1无此作用。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的：观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2．5基因的表达，从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法：实验于2005—08／2006—05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨，抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞，并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h，于诱导后1，2，3，4周，用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果：①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定，表达CD29，CD44，不表达CD34，CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后，骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化，诱导1周后，细胞体积增大，多呈长梭行，平行排列；诱导2周后，细胞变为短柱状，突起位于两端，相邻细胞的突起紧密接触；诱导3周后，短柱状细胞的突起相互连接，部分细胞可见类肌管样结构；诱导4周后，细胞体积变小，可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构，③诱导组细胞GATA-4和Nkx2．5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性，对照组为阴性，诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化，其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

5-氮胞苷诱导兔脂肪干细胞分化为心肌样细胞的特定基因表达

背景:采用生物学技术将脂肪干细胞进行心肌内移植,修复损伤心肌组织是近年来心血管病研究领域的一大热点。脂肪干细胞经诱导分化后的特定心肌基因表达尚无全面的研究报道。目的:观察兔脂肪干细胞经5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞后心肌特异性基因的表达。方法:取第2代脂肪干细胞,加入2.5,5,10,20,40,80μmol/L5-氮胞苷经24h作用后,用完全培养液对其继续进行培养,4周后再观察细胞生长和形态学的改变。待诱导1,2,3,4周,利用RT-PCR技术检测心钠素,脑钠素,α-骨骼肌动蛋白的基因表达。结果与结论:5-氮胞苷诱导1周,其细胞大多呈紧密平行排列,其体积有所增大,梭形细胞比例相对有所下降,40,80μmol/L组细胞形态变化明显。诱导第4周时,40,80μmol/L组细胞折光性减弱,细胞活性减弱,细胞死亡数继续增加。RT-PCR检测心钠素,脑钠素,α-骨骼肌动蛋白的基因表达呈逐渐增加趋势;10μmol/L组各基因的表达明显高于其他各组(P<0.05)。结果提示兔脂肪干细胞经5-氮胞苷诱导分化的细胞具有心肌细胞的某些基因的特异性表达。     

不同浓度血管紧张素Ⅱ诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的定向分化

背景：血管紧张素Ⅱ诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的实验研究还较少,目前对于这种新的诱导剂在实验应用中没有一个统一的浓度标准,所以诱导结果有一定的差异。目的：探讨血管紧张素Ⅱ诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度。方法：采用密度梯度离心＋贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,将第3代骨髓间充质干细胞分为0.05,0.1,0.2,0.5μmol/L血管紧张素Ⅱ组和对照组,血管紧张素Ⅱ各组接种后24 h加相应的诱导剂诱导24 h后,完全培养液连续培养4周,对照组只用完全培养液培养。采用MTT法检测各组第1,3,5,7天的吸光度值,计算各诱导组的细胞增殖抑制率。不同浓度血管紧张素Ⅱ诱导第1,4周时,免疫荧光细胞化学染色法检测心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC的表达,RT-PCR检测各组诱导培养4周时心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2-5的表达。结果与结论：各诱导组间的细胞增殖曲线相似,第5天0.05μmol/L血管紧张素Ⅱ组细胞增殖抑制率开始出现负值,与其他组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。第5,7天0.1μmol/L血管紧张素Ⅱ组细胞增殖抑制率明显低于0.2,0.5μmol/L血管紧张素Ⅱ组（P〈0.05）。经4种浓度血管紧张素Ⅱ诱导的骨髓间充质干细胞均表达心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC,对照组阴性。诱导培养1周,0.5μmol/L血管紧张素Ⅱ组c Tn T、β-MHC蛋白阳性表达率明显高于0.05μmol/L组（P〈0.05）。诱导培养4周,0.1μmol/L血管紧张素Ⅱ组的c Tn T、β-MHC蛋白阳性表达率与0.2μmol/L血管紧张素Ⅱ组差异无显著性意义（P〉0.05）。RT-PCR检测各组骨髓间充质干细胞经不同浓度血管紧张素Ⅱ诱导培养4周后心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2-5均有表达,对照组阴性。结果表明经血管紧张素Ⅱ诱导的骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC及心肌特异转录因子GATA-4、Nkx2-5,诱导分化适宜     

5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞分化为心肌样细胞的实验

目的:探讨5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞体外分化为肌细胞的可能性。方法:实验于2002-10/2003-03在西京医院心脏内科实验室完成。穿刺法抽取成年新西兰兔双侧股骨骨髓,分离培养骨髓间充质细胞,通过不同浓度的5-氮杂胞苷诱导24h后,继续培养3周,收集生长良好的诱导后7,14,21,28d的骨髓间充质细胞,以及第3代乳鼠心肌细胞做Westernblot检测。10μmol/L5-氮杂胞苷诱导分化3周的间充质细胞经胰酶消化后接种在多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片上做细胞爬片,CO2孵箱中培养48h后取出,磷酸盐缓冲液冲洗后加横纹肌α-肌动蛋白单抗室温孵育1h,洗涤后加入Cy3标记的羊抗鼠抗体,在37℃下摇床孵育1h,荧光显微镜下拍照。取诱导后3周处于对数生长期的细胞,制成超薄切片,铀-铅双染色,透射电镜下观察照相。结果:①倒置相差显微镜下观察5-氮杂胞苷诱导10d后可见细胞部分变成多角形状,14d后可见趋于融合的多核肌管样细胞结构。②West-ernblot检测横纹肌α-肌动蛋白在乳鼠心肌细胞和10μmol/L5-氮杂胞苷诱导后14,21,28d的兔间充质细胞中均有表达,心肌细胞的阳性条带最粗,其次为诱导后21d和28d的细胞,诱导后14d的细胞阳性条带最淡,诱导后7d的细胞未见阳性条带。③诱导后21d,10μmol/L5-氮杂胞苷处理的间充质细胞经横纹肌α-肌动蛋白免疫细胞荧光染色部分细胞呈阳性反应,提示有肌样细胞特性。④透射电镜检查局部放大示胞浆内有明显的Z线物质,之间有肌丝团样结构,构成类似原始的肌小节样结构。结论:成年兔骨髓间充质细胞在5-氮杂胞苷诱导下可向肌细胞分化,未分化为跳动的心肌样细胞。     

牵拉应力在5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞成肌过程中的动态效应

背景:国内外研究发现在一定力学环境下,体外培养的间充质干细胞其增殖分化等一系列生物学特性会发生相应变化.目的:体外观察5-氮杂胞苷与牵拉应力对大鼠骨髓间充质干细胞向肌细胞分化的调控作用.设计、时间及地点:2006-01/2007-06在上海交通大学牛物力学实验室完成的细胞观察实验.材料:清洁级3-4周龄雄性SD大鼠30只用于分离培养骨髓间充质干细胞,1～3d龄SD新生鼠4只用于建立骨骼肌阳性细胞株.化学诱导剂5-氮杂胞苷为Sigma公司产品,牵拉设备Fx-4000 Flexercell由美国Flexcell Int公司生产.方法:将传至第4代的骨髓间充质干细胞接种于Flex 6孔板.[1]设立5组行成肌家族因子表达Western-Blot检测:第1组细胞单纯经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周;第2～4组细胞以10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周后,在1Hz频率、15%幅度应力条件下分别牵拉12,24,36h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.[2]设立5组行诱导剂及牵拉应力作用的RT-PCR检测:第1组细胞给予1Hz频率、15%幅度应力牵拉24h;第2、3组分别经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1,2周;第4组细胞经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导2周后,给与同等应力牵拉24h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.主要观察指标:不同诱导条件及应力牵拉状态下骨髓间充质干细胞成肌家族因子的表达.结果:[1]第1组表达成肌因子MyoD与Myf5,成熟肌细胞标志MHC表达不显著;第2～4组MyoD与Myf5的表达明显增强(P<0.05),且随牵拉时间延长因子的表达逐步增强,MHC表达不显著.[2]第1组不表达成肌家族因子;第2组表达MyoD、 Myf5,第3组表达MyoD、 Myf5、 desmin,第4组几乎表达所有检測的肌细胞特异性标记.结论:经5-氮杂胞苷诱导可启动骨髓间充质干细胞向肌细胞分化,单独的牵拉应力不能诱导成肌.牵拉应力可调控5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化进程,并且与牵拉作用时间成正性相关.     

5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞分化为心肌样细胞的实验

目的：探讨5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞体外分化为肌细胞的可能性。 方法：实验于2002-10／2003-03在西京医院心脏内科实验室完成。穿刺法抽取成年新西兰兔双侧股骨骨髓，分离培养骨髓间充质细胞，通过不同浓度的5-氮杂胞苷诱导24h后，继续培养3周，收集生长良好的诱导后7，14，2l，28d的骨髓间充质细胞，以及第3代乳鼠心肌细胞做Western blot检测。10μmol／L5-氮杂胞苷诱导分化3周的间充质细胞经胰酶消化后接种在多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片上做细胞爬片，CO2孵箱中培养48h后取出，磷酸盐缓冲液冲洗后加横纹肌α-肌动蛋白单抗室温孵育1h，洗涤后加入Cy3标记的羊抗鼠抗体，在37℃下摇床孵育1h，荧光显微镜下拍照。取诱导后3周处于对数生长期的细胞．制成超薄切片，铀一铅双染色，透射电镜下观察照相。 结果：①倒置相差显微镜下观察5-氮杂胞苷诱导10d后可见细胞部分变成多角形状，14d后可见趋于融合的多核肌管样细胞结构。②Westem blot检测横纹肌α-肌动蛋白在乳鼠心肌细胞和10μmol／L 5-氮杂胞苷诱导后14，2l，28d的兔间充质细胞中均有表达，心肌细胞的阳性条带最粗，其次为诱导后21d和28d的细胞，诱导后14d的细胞阳性条带最淡，诱导后7d的细胞未见阳性条带。⑧诱导后21d，10μmol／L 5-氮杂胞苷处理的间充质细胞经横纹肌α-肌动蛋白免疫细胞荧光染色部分细胞呈阳性反应，提示有肌样细胞特性。④透射电镜检查局部放大示胞浆内有明显的Z线物质，之间有肌丝团样结构，构成类似原始的肌小节样结构。 结论：成年兔骨髓间充质细胞在5-氮杂胞苷诱导下可向肌细胞分化，未分化为跳动的心肌样细胞。     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.     

P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞 增殖和凋亡的影响

背景：5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂。目的：观察 P53 特异性抑制剂 PFT-α阻断 P53-P21 蛋白通路对 5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,取第 3 代细胞分为 4 组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组。观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT 法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用 Western blot 法测定诱导后P53、P21 蛋白表达情况。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞 2 周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44,CD45 阳性表达率分别为（89.98±1.29）%,（2.14±0.22）%。MTT 结果显示,当 PFT-α浓度≤20 μmol/L 时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到 40 μmol/L 时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖。培养第 5,7 天时,与其他 3 组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制（P〈0.01）。流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他 3 组（P〈0.01）。Western blot 结果显示,各组均有 P53、P21 蛋白的表达,以 5-氮杂胞苷组表达量明显增多。提示通过 P53 特异性抑制剂 PFT-α阻断 P53-P21 蛋白通路,能显著减少 5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进 5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的：以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中，或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞，均未发现心肌细胞特异蛋白表达。为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较。 方法：实验于2007-03／09在山西医科大学中心实验室完成。①动物：Wistar大鼠20只，新生1d龄Wistar乳鼠10只，均由山西医科大学动物房提供，清洁级，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品。②实验方法：自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞，取第1、2代制成1×10^9L^-1细胞悬液，-70℃放置4～5h后融化，吸管吹打，反复3次，离心取上清，过滤后即为心肌细胞冻融液，以此作为培养基体外模拟心肌微环境。自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞，取生长良好的第2代制成1×10^8L^-1细胞悬液，分为4组：血清对照组加入含15％胎牛血清的DMEM／F12培养基；5-氮杂胞苷组加入10μmol／L 5-氮杂胞苷37℃避光孵育24h后，换DMEM／F12培养基继续培养；5-氮杂胞苷＋心肌细胞冻融液组加入10μmol／L 5-氮杂胞苷诱导24h后，在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液；心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液。③实验评估：诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化，利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况。 结果：①体外模拟心肌微环境情况：培养7d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞簇搏动呈明显同步性。传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性。②骨髓间充质干?