单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤组织中的表达

目的:构建单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk,并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达。方法:实验于2003-07/12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室进行。在原核表达质粒pUChHyTk基础上,利用分子克隆技术,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/HSV-tk。取20只Wistar大鼠,全麻后背部浸入95℃水浴锅中,烫伤12s,造成30%Ⅲ度烫伤,烫伤后随机分为两组(n=10):①pcDNA3.1/tk组:烫伤后当天及第1,2,3,4周后于大鼠左后背部创面边缘(距创面边缘0.5cm)皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL眼3.6μgpcDNA3.1/tk(2μL) 10μL脂质体 180μL生理盐水演。②pcDNA3.1组:注射时间和方法同前,脂质体和质粒混合物为3.0μgpcDNA3.1(2μL) 10μL脂质体 180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠,取注射点附近皮肤,用反转录-聚合酶链反应法检测HSV-tk基因的表达。结果:20只大鼠全部进入结果分析。大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致,DNA测序结果表明tk基因已正确插入到pcDNA3.1质粒,说明了重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk已成功构建。反转录-聚合酶链反应结果显示脂质体介导的HSV-tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达。结论:应用分子克隆技术成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk,并在烫伤大鼠皮肤中得到了阳性表达。     

pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝铜代谢影响

目的探索以重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B进行TX小鼠基因治疗的初步疗效。方法以质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射,分别给予TX小鼠pcDNA3.0/APT7B 0、10、20、50、100、150μg,3 d后测定其肝铜含量(ng/mg,即每mg干重的肝组织中铜的含量),确定合适的治疗剂量。然后随机选取36只TX小鼠,随机分成3组,即注射生理盐水组、注射pcDNA3.0组、注射pcDNA3.0/ATP7B组。进行肝脏组织RT-PCR、W estern b lot检测和肝铜含量测定。结果根据预实验结果,取pcDNA3.0/APT7B 100μg/只为治疗剂量。RT-PCR和W estern b lot结果显示,加入pcDNA3.0/ATP7B组于加入后第3、7、14天均可见阳性条带。但以加入第3天时最明显。加入生理盐水组和加入pcDNA3.0质粒组均未见阳性条带。加入pcDNA3.0/APT7B组与生理盐水组及pcDNA3.0组比较,于加入第3、7天肝铜含量显著下降(P<0.05),以第3天下降最明显。加入第14天肝铜含量无显著下降,P>0.05。结论ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠的铜代谢有改善作用。     

Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤中的表达

目的:构建Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达情况。方法:实验于2003-07/12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室完成。利用原核表达质粒pUChIGF-I,通过分子克隆技术扩增Ⅰ型胰岛素样生长因子基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子。取20只Wistar大鼠,全麻后背部浸入95℃水浴锅中,烫伤12s,造成30%Ⅲ度烫伤,烫伤后随机分为两组(n=10),即cDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组及pcDNA3.1组。①pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组:烫伤后当天及第1,2,3,4周后于大鼠左后背部创面边缘(距创面边缘0.5cm)皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL眼3.6μgpcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水演。②pcDNA3.1组:注射时间和方法同前,脂质体和质粒混合物为3.0μgpcDNA3.1穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠,取注射点附近皮肤,应用免疫组化方法检测Ⅰ型胰岛素样生长因子基因的表达情况。结果:20只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致,DNA测序结果表明Ⅰ型胰岛素样生长因子基因已分别正确插入到pcDNA3.1质粒,提示成功构建了重组真核表达载体。②pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组大鼠皮肤组织中Ⅰ型胰岛素样生长因子呈现强阳性表达,pcDNA3.1组大鼠呈表达缺失或弱阳性表达。结论:应用分子克隆技术可以成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,Ⅰ型胰岛素样生长因子在烫伤大鼠皮肤中呈阳性表达。     

超声波与微泡声学造影剂增强基因定位转染动物实验研究

目的观察经静脉注射基因与微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏方式能否增强小鼠肝脏基因定位转染及其转染效率.方法昆明种小白鼠24只,随机分为4组,每组6只.第1组为单纯质粒转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg乙型肝炎核心抗原(pcDNA3.1/HBV)质粒的生理盐水溶液.第2组为单纯微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂.第3组为单纯超声转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的生理盐水溶液,同时采用频率为1 MHz、声强为0.5 W/cm2的超声波经小白鼠体表肝区辐照1 min.第4组为超声与微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂,同时经小白鼠体表肝区局部采用相同剂量超声辐照1 min.7天后处死小鼠,分别取肝、肾、肺、心、脾、骨骼肌组织进行pcDNA3.1/HBV免疫组化检测,记录不同组织每高倍视野(×400)pcDNA3.1/HBV表达阳性细胞数.结果第1、2组肝、肾组织内偶见pcDNA3.1/HBV表达弱阳性细胞,肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达阳性细胞.第3组肝组织内可见少量pcDNA3.1/HBV阳性细胞,每高倍视野表达阳性细胞(26.5±3.9)个.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.第4组肝组织内pcDNA3.1/HBV表达最强,每高倍视野表达阳性细胞(84.2±4.4)个,为第3组的约3.2倍.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.结论静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,能显著增强辐照部位局部组织的基因转染与表达,有望成为一种安全、高效的体内基因定位转染新技术.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤组织中的表达

目的：构建单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）基因重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达。方法：实验于2003～07／12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室进行。在原核表达质粒pUChHyTk基础上，利用分子克隆技术，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1／HSV—tk。取20只Wistar大鼠，全麻后背部浸入95℃水浴锅中，烫伤12s，造成30％Ⅲ度烫伤，烫伤后随机分为两组（n=10）：①pcDNA3．1／tk组：烫伤后当天及第1，2，3，4周后于大鼠左后背部创面边缘（距创面边缘0．5cm）皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL[3．6μg pcDNA3．1／tk（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水】。②pcDNA3．1组：注射时间和方法同前，脂质体和质粒混合物为3．0μg pcDNA3．1（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠，取注射点附近皮肤，用反转录-聚合酶链反应法检测HSV—tk基因的表达。结果：20只大鼠全部进入结果分析。大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致，DNA测序结果表明tk基因已正确插入到pcDNA3．1质粒，说明了重组真核表达载体pcDNA3.1／HSV—tk已成功构建。反转录-聚合酶链反应结果显示脂质体介导的HSV—tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达。结论：应用分子克隆技术成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并在烫伤大鼠皮肤中得到了阳性表达。     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的:构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法:通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论:酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

Virus-mediated gene transfer for cutaneous gene therapy

Cutaneous gene therapy offers unique opportunities and limitations in the use of viral vectors for corrective gene transfer. Skin presents a formidable barrier to microbial invasion and is nourished by small blood vessels, thus ruling out the possibility of directed virus delivery through cannulated blood vessels. However, skin is physically accessible and its resident keratinocyte stem cell population is susceptible to direct in vivo transduction with retroviral vectors. Furthermore, keratinocyte stem cells transduced in culture have been shown to persist and to express the encoded transgene when grafted to immunocompromised mice. Cutaneous gene therapy trials are likely to involve virus-mediated transduction as a principal means of gene transfer.     

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及5类抗生素耐药相关基因检测

目的了解本地区临床分离的金黄色葡萄球菌（SA）的耐药特点,探讨SA中耐消毒剂基因（qacA）、β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯-林可霉素-链阳菌素B类（MLSB）、四环素类、糖肽类药物耐药基因的存在情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）法对20株SA进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、MLSB类基因、四环素类基因、糖肽类基因、耐消毒剂基因检测。结果 PCR结果显示20株SA中13种耐药相关基因检出率分别为mecA75%、TEM90%、aac（6＇）/aph（2″）70%、ant（4＇,4″）15%、ant（6）-Ⅰ25%、ermA100%、ermC55%、msrA20%、msrB55%、tetM65%、qacA60%,vanA、vanB基因均为阴性。结论多数SA菌株具有耐多药特征,存在耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、MLSB类、四环素类等多种抗生素耐药基因,且对胺类、胍类消毒剂耐受。     

klotho gene

The klotho gene, originally identified by insertional mutagenesis in mice, suppresses multiple aging phenotypes(e.g. arteriosclerosis, pulmonary emphysema, osteoporosis, infertility, short lifespan). We have shown that mice deficient for the klotho gene show endothelial dysfunction as manifested by an attenuated response of aortic relaxation in response to acetylcholine stimulation. Nitric oxide production was also significantly reduced in klotho deficient mice. A decrease in klotho gene expression in animals under sustained circulatory and metabolic stress(e.g. atherosclerosis). The klotho gene delivery improves endothelial dysfunction through a pathway involving nitric oxide, and is involved in modulating vascular function(e.g. hypertension, vascular remodeling). Our findings establish the basis for the therapeutic potential of klotho gene delivery in atherosclerotic disease.