鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。结论:联     

鼻咽癌抗独特型单克隆抗体的主动免疫初探

用湖南鼻咽癌细胞株HNI2为免疫原,制备了数株抗鼻咽癌单抗(Abl).再用两株Abl(FC_2、HNI-5)为免疫原,制备了两株抗独特型单抗Ab2(2H4和5D3).体外和体内实验证实,2H4、5D3能替代鼻咽癌抗原,诱导体液和细胞免疫应答.因而认为它们可以作为新型抗鼻咽癌疫苗的候选物.选择19例晚期鼻咽癌病人用氢氧化铝凝胶沉淀的Ab2(Alum-2H4、Alum5D3),配合放疗进行主动免疫治疗;9例单纯接受放疗的晚期鼻咽癌病人作为对照组.经血清学检测发现,治疗组病人的抗抗独特型抗体(Ab3)、抗肿瘤抗体(Ab1’)水平均有不同程度增高,但也产生了人抗鼠抗体(HAMA).血清细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2水平在大多数治疗组病人中升高,而对照组Ab1 TNF-α、IFN-γIFM及IL-2血清水平均未升高.初步临床研究显示,鼠源性抗独特型单抗用于临床治疗是安全的,且Ab2能模拟肿瘤相关抗原,激发机体产生主动免疫应答.     

构建人源抗体库并筛选高亲和力抗大肠癌单链抗体

鼠源杂交瘤单克隆抗体用于体内时,由于其分子量大不易穿透入组织及诱发人体产生抗小鼠抗体(HAMA)反应,在体内应用效果不理想.为此,必须将鼠源单抗人源化.最好的策略是用噬菌体技术构建抗体库.但人淋巴细胞未经体内/外致敏,不易筛出特异性和亲和力高的抗体.国内外尚无结合体外致敏法和噬菌体呈现技术以改造鼠源单抗的报导.本研究拟建立抗原体外致敏淋巴细胞,RT-PCR克隆人抗体基因,噬菌体呈现技术构建人源抗体库并用单抗纯化的抗原筛选抗体库的策略,以人源化鼠源单抗Hb3.方法与结果:首先,用Hb3亲和层析纯化大肠癌相关抗原CA-Hb3,该抗原经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体     

大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库

建立杂交瘤单抗亲和层析纯化抗原、抗原体外致敏淋巴细胞和RT-PCR克隆人抗体基因及噬菌体呈现技术构建人源抗体库的策略.将亲和层析纯化的大肠癌相关抗原CA-Hb3经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体外致敏10个大肠癌病人各10ml外周血淋巴细胞(PBL),出现淋巴母细胞化和集落形成现象,提取总RNA并纯化mRNA,经RT-PCR扩增3种VH-CHI(γ)基因和5种VL-CL(κλ)基因,再经PCR克隆3种VH(γ)和8种VL(κλ)基因.通过(Gly_4Ser)_3相应的寡核苷酸连接序列将VH和VL基因不同组合连成24种单链抗体(ScFv)基因,经 SfiI酶切,将之克隆入fUSE 5RF,用电穿孔法将此表达载体转化MC1061,四环素抗性筛选得到10~6库容的初级抗体库,ScFv基因插入百分率为85%.该策略将可能普遍用于鼠源单抗人源化.     

抗内毒素噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建一个鼠源性的抗内毒素单链噬菌体抗体库,从中筛选出对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。方法从小鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因（VH,VL）,用Linker将VH,VL交联形成单链抗体可变区片段（ScFv）。经NotⅠ,SfiⅠ双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经ELISA检测抗内毒素ScFv。结果小鼠血清中抗内毒素的效价为1∶12800。提取的总RNA浓度为12.3813μg/ml,纯度较好。扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。结论成功地构建了一个库容量为1.9×107的鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库,并从中筛选出了2株抗内毒素ScFv。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠GMCSF融合蛋白(6B11mGM)的构建、表达和特性研究

抗独特型抗体能够模拟肿瘤抗原,调节机体免疫功能,已成为肿瘤免疫治疗研究中一个十分重要的研究领域.本中心制备的卵巢癌抗独特型抗体6B11能模拟卵巢癌抗原诱导特异性抗肿瘤免疫应答.为降低鼠源性单抗进入体内引起的不良免疫反应,本中心已成功制备了基因工程抗独特型单链抗体(6B11ScFv).为了增加6B11ScFv的免疫原性,又构建了6B11ScFv与人GM-CSF融合蛋白(6B11GM).但由于缺     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

抗独特型肿瘤疫苗的研究现状及前景

抗独特型抗体可以模拟原始肿瘤抗原成为抗独特型肿瘤疫苗(Ab2β瘤苗),已在一些动物试验和临床试验中诱发了抗肿瘤免疫反应,显示其成为一种新的癌症免疫疗法的前景。改进Ab2β瘤苗的制备方法,建立快速、可靠的Ab2β瘤苗对免疫系统影响的监测方法,阐明独特型网络抗肿瘤免疫反应机制,将为Ab2β瘤苗的临床应用铺平道路。     

抗独特型抗体对肿瘤的免疫治疗

1974年Jerne提出网络学说以来,对独特型(Id)、抗独特型(A-Id)、抗抗独特型调节网络进行了大量的研究,其中最受关注的是处于正负调节枢纽的Id环节,Id亦为抗原决定簇,为V基因编码的抗体和TCR表型.根据这一学说认为外在抗原为抗体中Id和T细胞受体所模仿,抗原注射于机体所产生的抗体为Ab1,而Ab1本身具有免疫原性产生A-Id抗体(Ab2),有一部分Ab2在三度空间模仿外在抗原,称     

用抗独特型疫苗主动免疫增强鼻咽癌病人的IL-2mRNA表达

用两株具有鼻咽癌相关抗原内影像的抗独特型单克隆抗体2H4,5D3,经氢氧化铝凝胶沉淀法制备成抗独特型疫苗Alum-2H4,Alum-5D3,对19例晚期鼻咽癌放疗病人作主动免疫治疗,9例放疗加生理盐水注射为对照组.用ELISA检测治疗前后病人血清抗体和细胞因子水平.用原位Northem杂交检测外周血单个核细胞(PBMC)IL-2mRNA的表达.发现接受Alum-2H4或Alum-5D3治疗的病人无1例有过敏或其他毒副反应,血清中均检测到抗抗独特型抗体(Ab3)、抗肿瘤抗体(Ab1’)水平均有不同程度的增高,但也产生了人抗鼠抗体(HAMA).血清细胞因子TNF-α,IFN-γ和IL-2水平在大多     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选

鼠源抗肿瘤单抗通常用杂交瘤技术制备。作者首次尝试以噬菌体抗体库技术替代杂交瘤方法制备抗肿瘤鼠单抗。以ＲＴ－ＰＣＲ方法直接从免疫Ｂａ１Ｂ／ｃ小鼠脾脏淋巴细胞扩增出全套免疫球蛋白重链Ｆｄ段及轻链基因，克隆到原核表达载体并将抗体片断Ｆａｂ表达于线状噬菌体表面，构建了噬菌体抗体库（１．０×１０￣７）。以人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７活细胞为靶抗原对噬菌体抗体库进行的４轮亲和筛选显示了噬菌体抗体的特异性富集。从第４轮筛选后选取１８２个克隆进行ＥＬＩＳＡ检测发现１７４个具有与肿瘤细胞结合活性。用１２种人肿瘤细胞系及人淋巴细胞和成纤维细胞对所获克隆进行了进一步鉴定。我们所应用的方法为抗肿瘤单抗的制备提供了一条更为有效的新途径。     

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的：利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法：从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞（PBMC）,提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链（VH）和轻链（VL）基因,经重叠延伸PCR（SOE-PCR）,在体外将两者连接成单链抗体（scFv）基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果：得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论：本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。     

小细胞肺癌抗独特型单链抗体的表达及活性研究

目的:在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法:从SCLC抗独特型抗体3F6小鼠杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录为cDNA。利用小鼠抗体骨架区共用引物,PCR扩增单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过人工设计的柔性连接肽(Gly4Ser)3连接构建3F6ScFv。再将其重组到原核表达载体pQE31中,构建3F6ScFv表达载体。转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,用NiNTA树脂对表达产物进行变性纯化。通过凝胶(SephacrylS200)柱上在位复性后,用竞争ELISA检测复性的3F6ScFv活性。结果:获得了SCLC抗独特型抗体3F6的VH和VL基因,构建了3F6ScFv表达质粒。在大肠杆菌中高效表达3F6ScFv,表达蛋白的相对分子质量为32×103,以包涵体形式存在。纯化后获得较纯的3F6ScFv蛋白,经复性后可竞争2F7抗体与SCLCNIHH128细胞结合。结论:成功构建、表达、纯化和复性了SCLC抗独特型抗体3F6ScFv,获得有活性的3F6ScFv,为SCLC抗独特型抗体的进一步研究奠定了基础。     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

卵巢癌基因工程抗独特型疫苗6B11和3D5的基础研究

抗独特型抗体(Ab_2βb)能够模拟肿瘤抗原,调节机体免疫功能,又被称为“抗独特型疫苗”,6B11为本中心制备的鼠单克隆抗独特型抗体,可模拟卵巢癌单抗OC166-9;3D5杂交瘤是用抗卵巢癌单抗OC125免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成,分泌的抗体能模拟卵巢癌相关抗原CA125.两种抗独特型抗体均可在体内外诱导产生特异性抗卵巢癌体液和细胞免疫反应.有可能作为“卵巢癌疫苗”用于卵巢癌的治疗.本研究利用分子克隆技术,对6B11和3D5在基因水平进行改造,构建6B11和3D5卵巢癌基因工程疫苗.     

用单克隆抗体筛选小细胞肺癌相关抗原基因

用分子生物学技术克隆肿瘤相关抗原基因对认识肿瘤抗原本质、深入研究肿瘤抗原的结构和功能、研究肿瘤多肽疫苗有重要意义。我们已获得一组抗人小细胞肺癌单克隆抗体,并在体外证实该抗体所识别的抗原在靶细胞有较好的特异性和较高分布密度,是多肽性抗原决定簇。在此基础上,以抗体为探针,筛选小细胞肺癌基因库,目的在于寻找编码抗体所识别抗原的肿瘤相关基因。 λgt_(11)噬菌体为载体构建的人小细胞肺癌细胞株NCI—H_(128)cDNA文库的效价约1.3×10~6,可在大肠杆菌系统和β-半乳糖苷酶构成融合蛋白的形式,表达插入的外源蛋白。我们用抗NCI-H_(128)单抗2F_7和E_6混合作为控针。碘_(125)用Iodogen方法标记在纯化的抗小鼠抗体上。10~7的菌斑转移到NC膜,经放射自显影,从中筛选到5个阳性菌斑,经4轮克隆化后,阳性斑达100％,对其中N0.4克隆进一步研究。该克隆的溶源菌经