磷酸三钙多孔生物陶瓷复合自体骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死模型的超微结构观察

背景：股骨头坏死病灶清除后的骨缺损难以修复,磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞的复合培养体内成骨的超微结构仍不明确。 目的：通过观察磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞复合培养体内成骨的超微结构,了解其在股骨头缺损修复中的成骨效应,验证磷酸三钙多孔生物陶瓷作为组织工程载体材料的可行性。 设计、时间及地点：随机对照开放性动物体内实验,于2008-02/08在中日友好医院骨坏死与骨循环实验室完成。 材料：体外培养兔骨髓间充质干细胞,并与β-磷酸三钙多孔陶瓷材料复合共同培养2周。 方法：新西兰大白兔30只,随机分为3组,制作股骨头坏死缺损模型后,空白对照不作填充,磷酸三钙组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞的复合物。 主要观察指标：通过环境扫描电镜观察骨髓间充质干细胞与材料的复合情况;回植体内6,12周后,取材,通过电镜观察磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞体内成骨的超微结构,了解材料降解及骨组织的替代过程。 结果：磷酸三钙多孔生物陶瓷与骨髓间充质干细胞复合培养良好。空白对照组缺损区6,12周均见纤维组织结构,无骨小梁结构;磷酸三钙组6周材料和骨基质交界不清,材料开始降解,12周材料与周围组织边界模糊,材料部分降解,多孔框架结构不清;磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组6周新生骨从宿主骨长出,12周可见成熟骨组织的连续平行纤维结构网络,材料降解,表面有较多的成骨细胞。后2组在股骨头缺损修复成骨方面优于空白对照组,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组成骨更佳。 结论：磷酸三钙多孔生物陶瓷是良好的组织工程支架材料,易与骨髓间充质干细胞复合,可用于股骨头坏死骨缺损的修复。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养*★

目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。 目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。 方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。 结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

骨性材料复合绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞研究体系的建立与应用

背景：由于骨性生物材料和骨组织本身坚硬致密的物理特性,限制了对生长在其中的靶细胞的示踪研究。 目的：针对骨性材料含钙、透光性差的特性,拟建立骨性材料复合绿色荧光蛋白基因标记的骨髓间充质干细胞的研究体系。 设计、时间及地点：体外观察实验,于2008-06/2009-01在南方医科大学南方医院骨与软骨再生医学重点实验室完成。 材料：β-磷酸三钙多孔骨性生物支架材料(1 cm×1 cm×0.8 cm)购自上海贝奥路生物材料有限公司。3月龄新西兰大白兔用于获取并培养骨髓间充质干细胞。 方法：①骨髓间充质干细胞以携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记后,接种于β-磷酸三钙骨性生物支架材料内部。②以荧光倒置显微镜观测材料中细胞的生长情况,并通过荧光定量聚合酶链反应等检测材料内部细胞的增殖情况。③以自创的半固体脱钙体系对复合细胞的材料脱钙后,制备连续冰冻切片观察;同时,采用不脱钙塑料包埋、扫描电镜等方法观察。 主要观察指标：骨性材料中绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的分布、形态及增殖情况。 结果：①荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞在材料内部生长、增殖。②普通聚合酶链反应可对材料内的绿色荧光细胞进行定性分析,荧光定量聚合酶链反应检测的Ct值和接种的绿色荧光细胞数量呈指数相关,故可以对材料中的绿色荧光细胞进行定量分析。③半固体脱钙可使骨性材料内部坚硬的钙质成分消失,而细胞所在的位置、形态和荧光不变;不脱钙塑料包埋可以原位保留细胞形态和荧光,但仅适用于小块组织;而扫描电镜观察范围有限,细胞无法保留荧光。 结论：建立了可在骨性材料内部方便、直观地追踪绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的体系,具有广泛的应用前景。     

人脐带间充质干细胞复合聚左旋乳酸多孔支架材料异位成骨的实验研究

摘要 背景：聚左旋乳酸材料有良好的支撑作用,具有三维模板作用,为细胞黏附、增殖和分化提供场所。 目的：以人脐带间充质干细胞作为种子细胞、多孔聚左旋乳酸作为支架材料构建组织工程化骨异位成骨的可行性及效果。 方法：制备聚左旋乳酸多孔支架材料。用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,传代培养、鉴定及诱导成骨,ALP染色检测骨向分化。将人脐带间充质干细胞与聚左旋乳酸材料复合培养,MTT及扫描电镜检测细胞增殖和细胞材料复合情况,应用矿化诱导7 d的细胞材料复合物植入兔大腿肌袋模型观察组织工程骨的异位成骨能力。4周后应用组织学观察新骨的形成情况。 结果与结论：与聚左旋乳酸多孔支架材料复合的人脐带间充质干细胞生长良好,细胞增殖未受影响,扫描电镜示细胞在支架材料上吸附、生长良好。体外对人脐带间充质干细胞骨向诱导后ALP染色阳性。矿化诱导的人脐带间充质干细胞复合聚左旋乳酸材料植入动物4周时,形成明显的块状组织,质地坚硬。组织学检查见新形成的组织有成骨细胞及其周围有血管长入。提示聚左旋乳酸多孔材料对种子细胞人脐带间充质干细胞的增殖无影响;人脐带间充质干细胞细胞与聚左旋乳酸多孔材料复合体可在异位形成骨组织。 关键词：人脐带间充质干细胞;聚乳酸;生物相容性;异位成骨;兔 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.008     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养*

背景：纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度。 设计、时间及地点：体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成。 材料：健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄。纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供。 方法：体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养。 主要观察指标：①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线。②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度。③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量。 结果：兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P < 0.01)。 结论：兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高。     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014     

低压细胞灌注多孔人工骨的成骨能力：与常压灌注的比较

背景：尽管利用低压脱泡细胞灌注法在多孔生物材料携带成骨细胞的体外研究取得令人满意的进展，然而是否能够提高动物体内工程组织骨的成骨能力还需要进一步探讨。 目的：采用低压方法在β-磷酸三钙材料内种植骨髓间充质干细胞，观察其复合体移植到大鼠体内后的成骨能力并与常压灌注法比较。 设计、时间及地点：组织学观察和生化学分析，对比实验。于2005-01/2006-02在东京医科齿科大学医学部骨科实验室完成。 材料：5 mm×5 mm×5 mm多孔生物材料磷酸三钙；实验动物为7周雄性Fischer-344大鼠8只，4只大鼠用于生化分析，另4只大鼠用于组织学分析。 方法：在体外培养扩增骨髓间充质细胞后，将细胞置于成骨分化的培养液中，通过常压（101.1 kPa）和低压（13.3 kPa）2种方法将细胞灌注入多孔生物材料磷酸三钙人工骨中。同时将Fischer-344背部两侧各取2个切口，低压种植的骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙移植到右侧皮下，常压种植的骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙移植到左侧皮下。 主要观察指标：通过扫描电镜观察组织工程骨内细胞种植情况；组织学观察和计算机图像分析移植3周和6周后体内组织工程骨成骨情况；检测组织工程骨碱性磷酸酶活性。 结果：扫描电镜观察低压细胞种植法灌注的多孔人工骨内存在更多的细胞;在移植后的第3，6周，低压组中碱性磷酸酶活性高于常压组，经过组织学观察和计算机图像分析处理，低压组比常压组有更均匀和更广泛的成骨量。 结论：低压细胞灌注提高骨生成能力明显优于常压灌注方法。     

血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

背景：利用载体或缓释系统负载生长因子,既能保护生长因子的生物活性,又可以使生长因子缓慢释放,从而持续促进细胞生长及组织修复再生,是目前控制释放载体材料应用研究的方向之一。 目的：观察血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统的体外缓释效果及与种子细胞的生物相容性。 方法：人骨髓间充质干细胞经体外诱导培养、扩增后种植于血管内皮生长因子+肝素/纤维连接蛋白+纳米晶胶原基骨支架(实验组)和单纯的纳米晶胶原基骨支架(对照组)行体外培养。测定缓释支架材料上血管内皮生长因子的释放量和持续时间;种植细胞后细胞的黏附率;培养3,7,10,14 d时支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及细胞在材料上的生长状况。 结果与结论：①该缓释支架具有一定的血管内皮生长因子缓释效果,持续时间可达14 d。②第3代人骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型：碱性磷酸酶细胞化学染色、I型胶原免疫荧光染色均为阳性。③体外实验显示该缓释支架与人骨髓间充质干细胞具有优良的生物相容性：相同时间点实验组的细胞黏附率、支架上细胞数量及细胞碱性磷酸酶活性均明显高于对照组;扫描电镜发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。 关键词：血管内皮生长因子;肝素;纤维连接蛋白;纳米晶胶原基骨;人骨髓间充质干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.019     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能*

摘要 背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性 ,具有良好的生物相容性。 目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。 关键词：纳米晶胶原基骨修复材料;骨髓间充质干细胞;支架;细胞培养;组织工程骨 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.003