人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化侵袭性大肠埃希氏茵毒力蛋白IpaC，为进一步研究侵袭性大肠埃希氏茵的发病机制奠定基础。方法：将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)，在异丙基硫代—β—D半乳糖苷(IPIG)诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS—PAGE鉴定，并采用QIAexpressionits^TM蛋白纯化系统纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63kD的条带，其含量约占总蛋白量的13％，对目的蛋白进行纯化后发现，以400mmol/L咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想，纯度可达90％以上。结论：pET32a—ipaC重组表达质粒转化大肠杆菌B121(λDE3)，可稳定、高效地表达目的蛋白；QIAexpressionist^TM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B蛋白的原核表达、纯化及其促PBMC增殖活性的测定

【目的】在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B蛋白，并对其进行纯化和测定其促人PBMC增殖活性。【方法】将构建的pGEX-Ag85B／BL21活化后接种于LB培养基中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，包涵体变性后经梯度浓度尿素复性，GST-Sephamse亲和层析、凝血酶切除GST并再次亲和层析纯化；MTT法测定重组Ag85B对人PBMC增殖的促进作用。【结果】成功在大肠杆菌中高效表达出GST／Ag85B融合蛋白，占菌体总蛋白的30％，主要以包涵体形式表达；包涵体复性后经GST-Sephamse亲和层析、凝血酶切除GST并再次亲和层析纯化获得纯度为96％的重组Ag85B蛋白；该蛋白能够促进人PBMC的增殖，增殖幅度随浓度增加而增加，刺激72h时达增殖最高峰。【结论】高效表达并纯化了结核分枝杆菌Ag85B蛋白，该蛋白具有促进人PBMC增殖的活性，为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。     

人SCF融合蛋白在大肠杆菌中表达

干细胞因子(SCF)是一种与造血细胞、生殖细胞和色素细胞生长发育相关的细胞因子。本研究利用pEX31B载体,在大肠杆菌中成功地表达出重组人SCF融合蛋白。该融合蛋白以包涵体形式存在,约占菌体蛋白的20％,经制备电泳纯化,纯度达90％以上,为制备人SCF单克隆抗体奠定了基础。     

重组人绒毛膜促性腺激素-β亚基的纯化及生物活性测定

目的 构建人绒毛膜促性腺激素（HCGB）原核表达载体PG5-HCGβ，使HCGβ在大肠杆菌中获得高效表达。建立一条简单、快速、高效的纯化复性路线，获得具有生物活性的高纯度rHCGβ。方法以本室克隆的PCRII／HCGB为模板，构建PG5-HCGβ，转化大肠杆菌BL21表达HCGβ。表达蛋白顺次用凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化。结果酶切及序列结果显示，PG5-HCGβ构建正确，HCGβ表达约占菌体总蛋白的20％。经过凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化，获得rHCGβ纯度达95％以上。复性的rHCGβ具有促进小鼠子宫生长的生物学活性。结论构建的PG5-HCGβ表达载体在大肠杆菌中获得高效表达，纯化复性的rHCGβ蛋白具有较高的生物学活性，为今后的rHCGβ生产打下了良好的基础。     

人瘦素分离纯化的实验研究

背景：瘦素是脂肪组织产生的一种激素，具有广泛的生理作用，也是近年能量代谢研究的热点之一，所用瘦素主要是大肠杆菌的表达产物，后者以不溶解的包含体形式存在，需要通过烦琐的复性过程才能获得具有生物学活性的人瘦素。目的：为获得天然溶解形式的人瘦素．探索其非亲和层析纯化条件，为进一步可能的产业化提供依据。设计：实验观察。单位：一所医学院的生化教研室分子生物学实验室。材料：选择强阴离子交换剂(Sepharose Q)和疏水介质(Phenyl Sepharose 6)在不同条件下进行层析的方法，以尽可能除去样品中的杂质。方法：将培养获得的上清液在pH7．5的条件下首先经过Q柱柱层析纯化，收集目的蛋白；随后在高盐[mol／L(NH4)2SO4]状态下通过疏水层析进一步纯化。主要观察指标：经凝胶扫描分析，纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42．3％，Q柱柱层析纯化后纯度达到89．6％，疏水层析进一步纯化后纯度达到96．2％。结果：纯化产物在SDS-PAGE上呈现单一条带。经凝胶扫描分析，纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42．3％，Q柱柱层析纯化后纯度达到89．6％，疏水层析进一步纯化后纯度达到96．2％。结论：通过强阳离子交换层析和疏水层析的合并应用，可将毕赤酵母表达系统表达的人瘦素进行有效纯化，纯度可达镍柱亲和层析的纯化结果，为进一步可能的产业化生产人瘦素提供了可靠依据和方法，为围绕瘦素的相关领域研究奠定了实验学基础。     

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的表达、纯化与功能鉴定

目的：建立重组人Flt3配体（rhFL)的原核高效表达系统及目标蛋白的纯化途径,为大规模获得rhFL产品,促进干细胞体外扩增,移植等新技术在临床的应用创造条件,方法：将FL细胞段cDNA与pProEXFT载体连接,重组体引入大肠菌菌并在异丙基－β－D－硫化半乳糖苷诱导下表达,提取包涵体,经变性,复性等处理,用金属离子螯合层析纯化表达产物,观察纯化所得rhFL刺激CD^ 34细胞的增殖情况,结果：rhFL的表达约占菌体蛋白总量的15％,经亲和纯化纯度达90％以上,rhFL CG-CSF＋Fpo刺激CD34^ 细胞增殖约400倍,结论：获得了rhFL在大肠肝菌中的高效表达,并初步建立了产物纯化途径,纯化后的rhFL具有产强的刺激造血干／祖细胞增殖的能力。     

乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究

目的 克隆乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法 自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcDNA,构建pQFA0-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果 表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论 成功地纯化出hMAM重组蛋白。     

神经细胞黏附分子L1-Ig（1-4）的原核表达及其功能

目的：利用基因克隆、表达、纯化等分子生物学手段获取具有生物活性的神经细胞黏附分子L1（L1）的Ig（1-4）结构域融合蛋白。 方法：实验于2001-10／2004-12在解放军第二军医大学神经生物教研室完成。①从新生4d的SD大鼠的海马组织中提取总RNA，采用反转录-聚合酶链反应法获取L1-Ig（1-4）基因，进行序列分析后构建表达载体pET28a（＋）-LI-Ig（1-4）。②转染大肠杆菌BL21，用IPTG诱导L1-Ig（1-4）的表达。③利用Ni2＋-NTA柱纯化和复性。④用L1-Ig（1-4）融合蛋白观察培养脊髓原代神经元轴突生长情况及其活性，未加入融合蛋白的细胞做对照。 结果：①克隆出编码正确的大鼠L1-Ig（1-4）基因。②并在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的28-3％。③Ni^2＋-NTA柱纯化后的纯度达90％以上。④加入融合蛋白后脊髓神经元突触的生长能力较未加入融合蛋白的细胞增强[（56&;#177;3．8），（43&;#177;2．7）μm，P〈0．01]。 结论：通过原核表达可大量获得L1-Ig（1-4）融合蛋白，该融合蛋白同样具有促神经生长的生物学活性。     

抗人白细胞介素31多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-31蛋白免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-31多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-31在大肠杆菌中表达，纯化hIL-31重组蛋白，免疫新西兰兔制备抗hIL-31多克隆抗体。Western-blot 鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。荧光定量PCR检测多克隆抗体对IL-31诱导MIP-3β分泌的阻断效应。结果：人IL-31经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30%，纯化后的蛋白纯度高；IL-31重组蛋白免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了效价达1：2560的多克隆抗体，可阻断IL-31刺激的MIP-3β的分泌。结论：原核表达的hIL-31蛋白能刺激家兔产生抗体，其多克隆抗体的效价高，具有阻断IL-31作用的生物学活性。     

HLA-A*0201-BSP融合基因的构建与原核表达

克隆表达可生物素化的HLA-A＊0201的重链胞外区是制备HLA-A＊0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A＊0201-BSP融合基因的表达载体，以制备HLA—A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从已鉴定为HLA—A＊0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA—A＊0201重链胞外区的基因．拼接上依赖生物素-蛋白连接酶（biotin-protein ligase，BirA）的可生物素化序列（BirA substrate peptide．BSP），构建HLA—A＊0201-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌DH50t中进行表达。结果表明：成功扩增出HLA—A＊0201-BSP融合基因并测序证实，构建的pBV220-HLA—A＊0201-BSP可在大肠杆菌DH50t中高效表达HLA—A＊0201-BSP融合蛋白．表达量占菌体总蛋白的28％，以包涵体的形式表达，经洗涤、变性后，以Sepharcyl S-300HR（S-300）柱层析纯化，纯度可达90％以上。结论：获得了高效表达HLA—A＊0201-BSP的大肠杆菌工程菌株，建立了简便有效的包涵体纯化方法，为制备HLA-A＊0201-肽四聚体奠定了基础。     

人α防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用

目的：分析α防御素3前体蛋白对于克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌效果，为进一步研究人类α防御素3的杀菌机制提供依据。方法：实验于2005—11／2006—09在上海交通大学生命科学技术学院刘建华实验室完成。将α防御素3前体的编码基因克隆到载体pDEST17中，载体转化入大肠杆菌DE3细胞，通过体外诱导及亲和纯化的方法获得α防御素3前体蛋白。根据在不同蛋白浓度下生存下来大肠杆菌和克雷伯菌所占的比例以及导致50％，90％和99％细菌死亡（LD50，LD90和LD99）时人α防御素3前体蛋白浓度来判断前体蛋白的杀菌作用。结果：①在1L培养基培养条件下，可获得纯化后α防御素3前体蛋白12mg，复性效率为15％-20％。②蛋白浓度为5，10，15和30mg／L时，克雷伯菌存活率分别为50％，33％，10％和4％。蛋白浓度为10，20，30和45mg／L时，大肠杆菌存活率分别为50％，10％，5％和1％。③克雷伯菌50％和99％致死率的蛋白质浓度为5和35mg／L。大肠杆菌50％和99％致死率的蛋白质浓度为10mg／L和45mg／L。结论：重组纯化的人α防御素3前体蛋白具有有效杀灭大肠杆菌和克雷伯菌的作用。     

核包膜蛋白gp210自身抗原基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定。方法从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段。将该段基因克隆入PET-30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达。融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定。结果在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体。重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白。ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础。     

链激酶基因的分离与表达及其单克隆抗体的制备(英文)

用PCR方法从链球菌染色体基因组中分离了链激酶基因,并把它克隆到表达载体pBV220中。诱导表达后重组蛋白以包涵体的形式存在并占菌体总蛋白的60％以上。纯化后的重组蛋白的纯度达90％以上。血纤维蛋白原平板测活方法表明,重组蛋白比活性为1.3×10~5U/mg。重组链激酶蛋白免疫小鼠后获得6株分泌抗链激酶单克隆抗体的杂交瘤。把重组链激酶基因克隆至M13mp19中进行DNA序列分析,结果表明与文献报道的有区别。     

人巨细胞病毒糖蛋白gp52的原核表达及初步应用

目的探讨以表达人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）中抗原性较强的蛋白片断代替全病毒抗原建立ＨＣＭＶＩｇＭ检测试剂盒的可行性。方法以聚合酶链反应扩增ＨＣＭＶ聚合酶辅助糖蛋白（ｇｐ５２）的有效抗原基因序列，导入带有高效转录启动子ｐＴｒｃ和６个串联组氨酸的原核表达载体ｐＴｒｃＨｉｓ，在大肠杆菌中表达，经金属鏊和亲和层析（ＩＭＡＣ）法纯化后，用酶联免疫吸附法检测新生儿血清，并与全病毒抗原检测进行比较。结果重组ｇｐ５２占大肠杆菌总蛋白的４０％，ＩＭＡＣ纯化后纯度达９４．５％。在４３份疑似ＨＣＭＶ感染的新生儿血清中阳性检出率为５１．２％，而用全病毒抗原检测阳性率只有２５．９％。结论ＨＣＭＶｇｐ５２蛋白具有良好的抗原性，可用于建立新一代的检测试剂盒。     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备rhIL-11

本研究探讨利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人白细胞介素11（rhIL-11）的工艺条件与参数。融合表达载体pET32a／IL-11在大肠杆菌E.coli B121（DE3）pLysS中诱导表达，裂解上清以Ni-NTA亲和纯化，通过DsbA-EKL-（His）。的自催化切割完成单体活性肠激酶催化亚基的释放，继而对Trx-IL-11行使酶促切割作用制备rhIL-11。结果表明：亲和纯化得重组融合蛋白Trx-IL-11 11.25mg／g湿菌，产品纯度达89.2％，回收率为91．8％。酶切体系经Ni-NTA resin充分吸附后．目标产品单体rhIL-11纯度大于95％。结论：利用肠激酶加工融合蛋白以制备rhIL-11的方法简单可行．分离纯化效果好，能够满足工业生产的需要。     

人IL-18突变体D134R的构建及其生物学活性分析

目的 研究IL-18结构与功能的关系。方法 用重叠延伸PCR定点突变技术构建人白介素18（hIL-18）突变体hIL-18D134R。将突变体eDNA与原核表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌DH5α。经热诱导表达蛋白质，SDS-PAGE证实，表达的目的蛋白质以包涵体形式存在。菌体经超声破碎后，包涵体以2mol／L尿素洗涤，8mol／L尿素溶解，并经Sephadex G-75柱纯化及稀释、透析复性。然后以诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生干扰素-γ（IFN-γ）及对核因子-κB（NF-κB）的激活能力为指标，检测突变体的生物学活性。结果 构建的突变体hIL-18D134R可在大肠杆菌DH5n中高效表达，经包涵体洗涤和Sephad G-75柱纯化后，纯度达92％以上。突变体D134R对IFN-γ的诱生能力及对NF-κB的激活能力分别为野生型hIL-18的19％和23％。结论 在人IL-18的氨基酸序列中，Asp134对其生物学功能有非常重要的作用。     

可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建町生物素化的H-2K^d-BSP融合基因的表达载体，原核表达H-2K^d-BSP融合蛋白，以制备H-2K^d-肽四聚体。方法采用RT—PCR技术从小鼠SP2／0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2K^d基因的胞外区，拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列（BSP）后，插入pET-22b高效表达载体多克隆位点，诱导表达后对表达产物进行纯化，用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2K^d-原核表达载体，测序证实H-2K^d-BSP融合基因序列正确。pET—H-2K^d原核表达载体可在大肠枰菌BL21中高效诱导表达H-2K^d-BSP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的36％，主要以包涵体形式表达；经反复洗涤纯化，纯化蛋白纯度可达90％以上。纯化蛋白可被H-2K^d分子特异性单克隆抗体SF1—1．1所识别。结论可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2K^d-肽四聚体奠定了实验基础。     

有双重活性的重组胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的分离纯化

背景：研究表明,将干扰素与胸腺素α1联合应用可增强干扰素的抗病毒作用。目的：获得既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1增强免疫功能的双重活性重组融合蛋白。设计、时间及地点：体外对比试验,于2003—03／2004—12在重庆康尔威药业股份有限公司药物研究所完成。材料：融合基因片断由上海生工合成,人羊膜细胞、水泡性口炎病毒购自上海生化与细胞生物所,对照品IFNα1b、IFNα2a和胸腺素α1为市售药品。方法：选择大肠杆菌偏爱的密码子,将合成的胸腺素α1与复合干扰素编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b（＋）、在宿主菌BL21（DE3）-Codon plus-RP-X中表达融合蛋白。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析等方法进行分离纯化。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。主要观察指标：重组融合蛋白抗病毒的活性和促小鼠脾淋巴细胞增殖活性。结果：①在大肠杆菌中表达的融合蛋白呈胞内可溶性表达,表达量占细菌总蛋白的20％以上。②纯化后,融合蛋白的纯度达96％以上。③融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b、IFNα2a。④融合蛋白的促淋巴细胞增殖活性与市售胸腺素α1相似。结论：在大肠杆菌中表达的胸腺素α1与复合干扰索融合蛋白既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1的增强免疫功能。