壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率

背景非病毒载体具有低毒,低免疫反应,靶向性和易于组装等优点已成为目前研究基因转染的热点.目的评价壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率和细胞毒性.设计观察对比实验.单位华中科技大学同济医学院环境医学研究所.材料Zeta电位/粒度分析仪;荧光分光光度计;Hoechst 33258;PLPS-3'EGFP质粒;肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2.方法实验于2004-12/2005-12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成.用绿色荧光蛋白基因做报告基因,复凝聚方法制备壳聚糖绿色荧光蛋白质粒纳米粒.②采用扫描电镜观察制备的纳米粒形态;Zeta电位/粒度分析仪测量纳米粒的粒径和表面电位;酶保护试验检测纳米粒的抗DNA酶降解性能.③体外转染人肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞A549.分别在24,48和72 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况.④纳米粒细胞毒性分析采用四甲基偶氮唑盐试验.主要观察指标①纳米粒的包封率与理化特征.②纳米粒的细胞转染效率.③纳米粒的细胞毒性.结果①纳米粒的包封率与理化特征壳聚糖纳米粒的核酸包封率为91.7%,纳米粒多呈球形,平均粒径149 nm,表面电位+20.5 mV.壳聚糖纳米粒能保护DNA不受DNA酶Ⅰ降解.②纳米粒的细胞转染效率48 h后转染率达到高峰,A549转染率为95%;而HepG2只有10%左右.③纳米粒的细胞毒性纳米粒和壳聚糖溶液均能抑制HepG2和A549生长,壳聚糖溶液对细胞生长的抑制作用强于纳米粒.结论壳聚糖质粒纳米粒能转染HepG2和A549两种肿瘤细胞,且对两种肿瘤细胞的生长有抑制作用,提示壳聚糖纳米粒能作为DNA的载体,用于肿瘤细胞的转染.     

壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率

背景：非病毒载体具有低毒，低免疫反应，靶向性和易于组装等优点已成为目前研究基因转染的热点。目的：评价壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率和细胞毒性。设计：观察对比实验。单位：华中科技大学同济医学院环境医学研究所。材料：Zeta电位／粒度分析仪；荧光分光光度计；Hoechst 33258；PLPS-3’EGFP质粒；肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2。方法：实验于2004—12／2005—12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成。用绿色荧光蛋白基因做报告基因，复凝聚方法制备壳聚糖绿色荧光蛋白质粒纳米粒。②采用扫描电镜观察制备的纳米粒形态；Zeta电位／粒度分析仪测量纳米粒的粒径和表面电位；酶保护试验检测纳米粒的抗DNA酶降解性能。③体外转染人肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549。分别在24，48和72h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。④纳米粒细胞毒性分析采用四甲基偶氮唑盐试验。主要观察指标：①纳米粒的包封率与理化特征。②纳米粒的细胞转染效率。③纳米粒的细胞毒性。结果：①纳米粒的包封率与理化特征：壳聚糖纳米粒的核酸包封率为91．7％，纳米粒多呈球形，平均粒径149nm，表面电位＋20．5mV。壳聚糖纳米粒能保护DNA不受DNA酶Ⅰ降解。②纳米粒的细胞转染效率：48h后转染率达到高峰，A549转染率为95％；而HepG2只有10％左右。③纳米粒的细胞毒性：纳米粒和壳聚糖溶液均能抑制HepG2和A549生长，壳聚糖溶液对细胞生长的抑制作用强于纳米粒。结论：壳聚糖质粒纳米粒能转染HepG2和A549两种肿瘤细胞，且对两种肿瘤细胞的生长有抑制作用，提示壳聚糖纳米粒能作为DNA的载体．用于肿瘤细胞的转染。     

转化生长因子β1基因缓释的壳聚糖纳米粒制备及体外检测

背景：壳聚糖作为一种非病毒载体,具有低毒性、低免疫原性、良好的生物相容性以及带可高正电荷密度的特性,易与带负电荷的DNA通过静电作用形成相互作用体避免核酸酶的降解。目的：构建负载重组人转化生长因子β1基因的壳聚糖纳米粒,检测其体外缓释转化生长因子β1基因及对软骨细胞基因转染等性能。方法：将壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因和转化生长因子β1基因的质粒DNA（pDNA）以复凝聚法制成壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒。结果与结论：制备的壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒呈球形,粒径、表面电位与pH值相关,随着pH值升高,粒径增大,表面电位减少。纳米粒可有效保护pDNA免受核酸酶的降解。纳米粒的pDNA包封率为（87.5±2.3）%;pDNA可从纳米粒中缓慢释放。体外转染实验证实壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒能转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白。提示壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒能有效保护pDNA免受核酸酶降解,具有良好的缓释转化生长因子β1基因的能力,并能介导基因转染软骨细胞。     

壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究

背景:非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注,各种各样的非病毒载体处在不断的研究中,壳聚糖季铵盐作为一种新的生物材料,同样也具有作为基因递送载体的潜质.目的:考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性,寻求一种新的非病毒基因载体递送系统.设计、时间及单位:对比观察实验,于2008-04/12在浙江省医学科学院生物工程所完成.材料:质粒pcDNA3.1-EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存.以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐,用复凝聚法制备载基因纳米粒.方法:凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力,DNase Ⅰ的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果.通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响,寻求本递送系统较好的转染条件.另外,用MTT法测定壳聚糖季铵盐的细胞毒性.主要观察指标:壳聚糖季铵盐和pcDNA 3.1-EGFP以何种比例结合形成的纳米粒、转染液中有无牛血清,质粒的量为多少时对人胚肾T细胞的转染效率足最高的;不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响.结果:壳聚糖季钱盐纳米粒能转入人胚肾T细胞,虽然转染效率略逊丁聚乙烯亚胺,但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺.壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72 h后效率较高,经综合分析,当pcDNA质量为2 μg,壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒,在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染,转染效率足最高的.结论:壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进一步的研究.     

叶酸-壳聚糖介导survivin shRNA基因纳米载体的制备

背景:叶酸-壳聚糖纳米粒是一种新犁的高靶向纳米载体,可进一步提高药物的靶向性,并进一步实现缓释和控释给药.目的:探讨叶酸-壳聚糖纳米粒作为survivin shRNA重组质粒载体传递系统的可行性以及对大肠癌细胞(SW480)的转染效率.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-06/2009-01在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:壳聚糖(脱乙酰度>90%)由上海伯奥生物科技有限公司提供,叶酸由国药集团化学试剂有限公司提供,survivin shRNA重组质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供.方法:首先制备粒径均匀的叶酸偶联壳聚糖纳米粒,然后将20 mg/L survivin shRNA重组质粒和10 mg/L叶酸-壳聚糖混合制各基因纳米复合物,同时以阳离子脂质体基因复合物作为对照,将上述两者转染大肠癌细胞.主要观察指标:基因纳米复合物的理化性质及转染效率;Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达.结果:成功制备叶酸-壳聚糖介导的survivin shRNA重组质粒基因纳米复合物.该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的效果强于阳离子脂质体基因复合物.且转染后大肠癌细胞中survivin蛋白的表达显著低于阳离子脂质体基因复合物.结论:叶酸-壳聚糖纳米粒作为载体系统能将survivin shRNA重组质粒商效递送到大肠癌细胞,从而诱导人大肠癌细胞的凋亡.     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景:作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的:制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法:通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论:成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为(94.32±0.35)%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景：作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的：制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法：通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论：成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为（94.32±0.35）%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的表面修饰和转染

背景:聚氰基丙烯酸烷基酯在人体内极易生物降解,且对许多组织具有生物相容性,近年来一直受到国内外医药界的广泛关注.目的:比较不同表面修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的物理化学性质,并考察它们体外基因转染活性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-09/12在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:采用乳化聚合的方法制备表面分别修饰壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇的聚氰基丙烯酸正,‘酯纳米颗粒.方法:透射电镜观察粒径大小、纳米粒形态;Zetasizer Nano system电位分析仪测定Zeta电位;MTT法检测纳米粒的细胞毒性;用流式细胞仪考察纳米粒的体外转染效率.主要观察指标:纳米粒的表面电位、粒径、细胞毒性及其转染效率.结果:成功制备了粒径约200 nm左右,表面电位分别为25.53,-17.42和0.293 5 mV的壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒,且0.1 g/L的质量浓度对HepG2细胞无明显毒性,带正电的壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的转染效率明显高于葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的纳米粒.结论:聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒经表面修饰不同物质后可以带上正电、负电及中性电荷,而壳聚糖修饰的纳米粒能有效地将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,可用做基因递送的载体.     

包裹pHEV23纳米壳聚糖的制备和特性

背景：裸DNA在基因治疗中易被体内核酸酶降解。携载DNA疫苗的病毒类载体存在致癌和引发免疫应答等安全问题，且制备方法复杂。非病毒载体（尤其是阳离子-DNA聚合物）具有低毒，低免疫反应，能重复给药，易于大量制备等优点。壳聚糖是一种天然阳离子碱性聚多糖，具有良好的生物可降解性、生物相容性及生物安全性。 目的：制备含质粒pHEV23的纳米壳聚糖，观察其表征及对DNA的保护作用。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-06／2008-05在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。 材料：壳聚糖，脱乙酰度88％，批号061220，由青岛利中甲壳质公司提供。质粒pHEV23为浙江省医学科学院生物工程研究所实验室提供。 方法：通过脱水剂Na2SO4诱导的复凝聚沉淀法制备含质粒pHEV23的纳米壳聚糖。根据壳聚糖质量浓度1．4，0．7，0．4g／L，分别制备壳聚糖（高）-pHEV23、壳聚糖（中）-pHEV23、壳聚糖（低）-pHEV23。主要观察指标：激光纳米粒度分析仪测定壳聚糖-pHEV23粒径、Zeta电位；紫外分光光度计检测包封率；凝胶阻滞实验分析壳聚糖和pHEV23的聚合：DNase Ⅰ的保护试验分析壳聚糖-pHEV23的抵抗核酸酶降解能力；释放实验评价壳聚糖-pHEV23的稳定性。 结果：制备的壳聚糖-pHEV23粒径在170～470nm，其中壳聚糖（低）-pHEV23 171．6nm，壳聚糖（中）-pHEV23 387．0nm，壳聚糖（高）-pHEV23 467．3nm。壳聚糖（低）-pHEV23 Zeta电位为＋22．9mV。包封率均〉95％，其中壳聚糖（低）-pHEV23 95．8％，壳聚糖（中）-pHEV23 96．7％，壳聚糖（高）-pHEV23 97．1％。凝胶阻滞分析表明，壳聚糖和pHEV23之间通过静电作用完全结合，纳米粒带正电荷。DNase Ⅰ保护试验表明，壳聚糖-pHEV23能有效抵抗DNase Ⅰ酶降解，对pHEV23有保护作用。稳定性试验表明，4℃保存60d，纳米粒仍能较稳定地包裹pHEV23。 结论：壳聚糖-pHEV23能高效装载外源DNA，稳定性良好，并保护其免受核酸酶的降解。     

负载紫杉醇壳聚糖纳米粒的制备、表征与释药性能

背景:紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物,但其水溶性极低.壳聚精经接枝改性,生成的共聚物可在液相中生成纳米粒,可用于药物的缓释和控释.目的:对制备的负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒进行表征,分析其体外药物释放能力.设计、时间及地点:重复测餐设计,于2008-01/07在华北煤炭医学院医学系实验室完成.材料:壳聚糖,平均相对分子质量为2.0X 105,脱乙酰度为92%,为浙江省玉环海洋生物化学有限公司产品.紫杉醇,批号082329802,为中国药品生物制品检定所产品.方法:采用引发接枝效率高、引发反应条件温和的二羟基二过碘酸合镍钾为引发剂,在壳聚糖上接枝醋酸乙烯酯,该聚合物在水溶液中直接生成具有疏水核心、亲水表面的纳米粒,即壳聚糖纳米粒,再利用超声振荡技术将0.5～5.0 mg紫杉醇与上述纳米粒混合制成负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒.主要观察指标:激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位,透射电镜观察纳米颗粒的外观形态,高效液相色谱法分析负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒的包封率、载药量和释药性能.结果:壳聚糖纳米粒和负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒,其粒径分别为196.2 nm和320.8 nm,粒径分布较窄,纳米粒表面均带正电荷,Zeta电位比较差异无显著件意义(F=0.818,F=-3.38,P均0.05).稳定的纳米粒呈球形,粒径均匀.紫杉醇的加入量可影响纳米粒的包封率,紫杉醇的加入量为纳米粒的量2%时,达到最大包封率93.6%.体外模拟释药结粜表明药物释放曲线分为两个阶段,突释阶段微球释药量在24 h内达48.3%,缓释阶段微球释药持续时间长,在175 h时释药量达75.9%.载药纳米粒的药物释放速率持续稳定.结论:接枝共聚法制备壳聚糖纳米粒简便可靠,负载紫杉醇后纳米粒径明显变大,表面带有正电荷,且纳米粒对紫杉醇有很高的包封率.体外释药具有明显的缓释作用.     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

Effects of alginate inclusion on the vector properties of chitosan-based nanoparticles.

Chitosan nanoparticles have shown considerable promise as gene vectors but do not mediate transfection with satisfactory efficiency. To improve upon the transfection efficiency of chitosan, we approached the development of alginate-chitosan nanoparticles with the goals of maintaining low toxicity and biocompatibility. Through ionic gelation, particles were formed with a mean Z-average diameter of 157 nm and a zeta potential of +32 mV. Competition binding assays indicated that the presence of alginate reduces the strength of interaction between chitosan and DNA, contributing to improved transfection. Cell viability assays indicated that nanoparticles exhibit the same low toxicity as chitosan, and significantly reduced toxicity compared to a commercial liposome formulation. As well, complexation with nanoparticles maintained DNA integrity and protected it from nuclease degradation better than chitosan alone. Alginate-chitosan nanoparticles were able to mediate transfection of 293T cells four times that achieved by chitosan nanoparticles; at 48 h, the transfection efficiency was as high as with Lipofectamine, with significantly reduced cytotoxicity. Overall, alginate inclusion improved the vector properties of chitosan-based nanoparticles, demonstrating superior transfection ability while maintaining biocompatibility and low toxicity.     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

Chitosan nanoparticles as non-viral gene delivery systems: Determination of loading efficiency

Chitosan has been studied for use in particle delivery systems for therapeutic purposes, since one of its most important applications is as a non-viral vector in gene therapy. Due to its positive charge, it is capable of forming DNA complexes (polyplexes) obtained through several methods and with the property of protecting nucleic acids. Two methods for obtaining the nanoparticles of chitosan-nucleic acids are reported in this study: simple complexation (of depolymerized chitosan or of different chitosan salts with plasmid) and ionic gelation (by adsorption of plasmid in the nanoparticles or by encapsulation of plasmid into nanoparticles). The determination of the loading efficiency of chitosan nanoparticles with the plasmid is carried out by electrophoretic mobility of the samples on agarose gel. Furthermore, the nanoparticles have been characterized according to their morphology, size and surface charge using AFM, TEM, laser diffraction and dynamic light scattering techniques. The polyplexes obtained have been found to be spherical and nanometric in size (between 100–230 nm) with a zeta potential between 37 and 48 mV. Positive results have been obtained by agarose gel electrophoresis for all studied cases: a concentration of between 20 and 30 μg/mL of chitosan salts is required while for the remaining chitosan samples studied, 100% loading efficiency does not occur until a concentration equal to 100 μg/mL (regardless of previous depolymerisation and the method performed). Chitosan–plasmid nanocapsules have been obtained at the polymer concentrations worked with (between 0.025 and 0.2%).     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建与临床应用

目的构建经血管内皮生长因子165(VEGF165)转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,并对其在促进深度烧伤患者创面愈合过程中的作用进行评价。方法将30例深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者随机分为2组,每组15例。移植转染有VEGF165成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物组为实验组,单纯脱细胞异种真皮替代物移植组为对照组。采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的人成纤维细胞,再将转染后的人成纤维细胞接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于深度烧伤患者切痂后创面,对创面愈合情况进行观察并与单纯脱细胞真皮移植组进行比较。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165可成功转染人成纤维细胞,经转染的人成纤维细胞可顺利接种于脱细胞真皮形成成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,替代物移植后实验组患者皮片成活率(90.25±5.39)%,对照组患者皮片成活率(83.98±3.63)%,两者有显著性差异(t=3.737,P<0.01)。实验组新生的毛细血管数量要明显多于对照组。结论经VEGF165转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物具有显著的促进深度烧伤患者创面愈合的作用。     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。