TNFα激活的星形胶质细胞在慢性癫痫复发中的作用

目的：研究TNFα激活的星形胶质细胞在慢性癫痫复发中的作用。方法：分别用反相高效液相色谱法和免疫组织化学反应检测细胞释放谷氨酸（Glu）和NF－κBp65表达的变化。将TNFα激活的星形胶质细胞条件培养液（ACM）注射入慢性马桑内酯致痫发作间期大鼠之侧脑室，观察动物行为和脑电图的变化，并用免疫组织化学反应观察海马NF－kBp65和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化。结果：1．TNFα可明显促进星形胶质细胞释放Glu，并快速诱导星形胶质细胞核内NF－kBp65的表达。2．侧脑室注射ACM可引起大鼠4级癫痫行为及典型的痫样脑电图表现；注射ACM后0．5h即可观察到海马回特别是CA1区细胞核内p65的表达，2－4h达高峰，8h恢复至对照水平；注射ACM后1h海马GFAP免疫反应阳性细胞数开始高于对照组，4h达高峰，8h仍明显高于对照组。结论：TNFα激活的星形胶质细胞可通过释放可溶性的神经活性物质引起慢性癫痫的复发。     

激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α对大鼠离子型谷氨酸受体1表达的影响

目的探讨星形胶质细胞在癫痫发病中的作用。方法选用肿瘤坏死因子TNF-α(TNF-α)刺激及TNF-α反义寡核苷酸阻断后马桑内酯(CL)刺激纯化培养的海马星形胶质细胞，将这两种条件培养基提取液(ACM)10μl分别注入正常大鼠侧脑室，观察动物行为与脑电图的变化；用免疫细胞化学方法检测大脑皮质与海马中离子型谷氨酸受体(NMDARI)表达水平的改变，并做显微图像分析。结果1．侧脑室注射肿瘤坏死因子TNF-α刺激后的条件培养基提取液可引起大鼠Ⅲ级癫痫样发作及典型的尖波、棘波、棘-慢波癫痫样脑电图表现，大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值均明显高于对照组；2．侧脑室注射TNF-α反义寡核苷酸阻断后由马桑内酯刺激的条件培养基提取液，大鼠无癫痫样行为发生，大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值与对照组无显著性差异。结论1．激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α可诱导大鼠癫痫发作。2．NMDAR1表达的变化可能与癫痫发作有关。     

IL-2基因修饰成纤维细胞对肝癌荷瘤小鼠的治疗实验

目的研究双顺反子逆转录病毒载体介导ＩＬ－２基因转导成纤维细胞对小鼠肝癌的治疗作用。方法利用双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＩＬ－２将ＩＬ－２基因转导小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，然后将分泌ＩＬ－２的成纤维细胞与６０Ｇｙγ射线照射的肝癌Ｈ２２细胞皮下植入三天前５×１０５或２．２×１０５肝癌Ｈ２２细胞皮下注射的ＢＡＬＢ／ｃ鼠。结果分泌ＩＬ－２的成纤维细胞治疗组能明显增加荷瘤小鼠的生存率（Ｐ＜０．０２５），抑制肿瘤生长（Ｐ＜０．０５），在肿瘤植入第７０天无肿瘤形成的小鼠再次注射１×１０６Ｈ２２细胞仍然不发生肿瘤。５１Ｃｒ释放试验表明来自照射Ｈ２２与分泌ＩＬ－２成纤维细胞混合液注射的小鼠脾细胞与５１Ｃｒ标记的Ｈ２２细胞共培养后，５１Ｃｒ特异释放明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论实验结果表明ＩＬ－２基因修饰的成纤维细胞能诱导针对肝癌的特异免疫反应。     

内毒素性发热时大鼠脾细胞增殖反应及IL－1、IL－2活性测定

本实验用大鼠腹腔注射内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ＥＴ）复制发热模型。动物注射ＥＴ后８０ｍｉｎ体温上升达高峰（０．９７±０．２１℃），立即处死动物，检测大鼠脾细胞增殖反应ＩＬ－１、ＩＬ－２活性。实验结果如下：（１）ＥＴ性发热时大鼠脾细胞在无丝裂原的作用下￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入的ｃｐｍ值明显高于对照组。（２）ＥＴ组大鼠脾细胞对刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ，ＣｏｎＡ）的反应性显著高于对照组。（３）ＥＴ组大鼠脾细胞产生ＩＬ－１，ＩＬ－２的能力显著高于对照组。     

羧甲基茯苓多糖对HPBL分泌IL—2,TNF,IL—6,IFN—γ的调节作用

用ＣＭＰ培养外周血淋巴细胞（ＨＰＢＬ）２４、３６、４８、７２ｈ采样检测的ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ效价分别可达１３．６±４．３，４１．９±２．０，１８３７．４±４６４．３，１０３７．９±２１１．０Ｕ／ｍｌ，分别比无ＣＭＰ的细胞培养对照组的效价高０．８，７．４，０．５，１０．９倍（Ｐ＜０．０１），说明ＣＭＰ具有ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ的诱生剂功能。由ＣＭＰ预处理ＨＰＢＬ后经ＰＨＡ和／或ＣｏｎＡ促诱生组的ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ效价分别比无ＣＭＰ的ＰＨＡ和／或ＣｏｎＡ刺激的相应常规诱生组高１．２～２．８，０．５～１．１、０．５～０．８、０．４～０．６倍（Ｐ＜０．０１），尤以ＣＭＰ＋ＰＨＡ＋ＣｏｎＡ促诱生细胞因子效果最佳（Ｐ＜０．０１），说明ＣＭＰ又具有ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ促诱生效应。     

脑缺血时大鼠海马及其生长抑素神经元的超微结构改变

夹闭大鼠双侧颈总动脉２ｈ，对海马ＣＡ１区进行免疫电镜观察，可见实验组ＣＡ１区部分锥体细胞的胞核固缩、核染色质溶解、细胞器减少或消失；部分神经纤维的髓鞘显示轻度变性图像；部分神经末梢变性；星形胶质细胞突起肿胀；小胶质细胞活跃并包裹断离的髓鞘；生长抑素免疫反应阳性神经末梢比对照组显著增多，生长抑素阳性轴突可与阴性树突形成轴－树突触。以上结果提示：缺血可导致海马ＣＡ１区神经元发生不同程度的损伤和胶质细胞     

动脉粥样硬化大鼠弓状核内β－内啡肽免疫反应阳性细胞的变化

用免疫细胞化学ＰＡＰ法和计算机图象分析技术，对动脉粥样硬化大鼠下丘脑弓状核β－内啡肽免疫反应阳性细胞的变化进行半定量研究。结果发现；动脉粥样硬化大鼠的下丘脑弓状核内β－ＥＮＤ阳性细胞数量增加，实验组和对照组在单位剖面弓状核内，阳性细胞数分别为２９．１±５．１和１５．５±４．２个。计算机图象分析其阳性细胞的积分光密度，实验组和对照组分别为０．１１４４６±０．０５１３和０．０８３３０±０．０４１６，经统计学处理，两组之间阳性细胞和ＩＯＤ都具有显著差异（Ｐ＜０．０５）。本文提示：下丘脑弓状核内β－ＥＮＤ样阳性神经元对动脉粥样硬化的形成和／或调控过程可能有一定影响。     

枸杞对IL－2产生和IL－2受体（α，β）表达的调节

枸杞对于ＰＨＡ活化的淋巴细胞的ＩＬ－２产生有明显的促进作用（Ｐ＜０．０５）；ＡＰＡＡＰ和ＦＡｃＳ检测表明，枸杞对经ＰＨＡ活化的淋巴细胞的ＩＬ－２受体α和β的表达有明显的促进作用；ＦＡＣＳ分析同时表明拘杞不仅使高表达ＩＬ－２Ｒ（α，β）的细胞数量增加．同时也促进细胞表面的ＩＬ－２Ｒ（α，β）表达量的增加．利用ＹＴ细胞检测的结果表明在构杞的作用下，ＹＴ细胞的ＩＬ－２Ｒ（α，β）的表达都有所增加，提示构杞对ＩＬ－２受体的表达有直接的调节作用。     

IL—2对神经元NMDAR1m RNA表达和细胞内钙浓度的影响

Ｎ－甲基－Ｄ－天门冬氨酸（ＮＭＤＡ）受体和细胞内游离钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）的变化与神经元的兴奋性关系密切。本文报道以大鼠大脑皮层神经元为研究对象，通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交并以Ｆｕｒａ－２作为Ｃａ２＋荧光指示剂，观察了外源性白细胞介素－２（ＩＬ－２）对ＮＭＤＡ受体１型亚单位（ＮＭＤＡＲ１）ｍＲＮＡ表达量及［Ｃａ２＋］ｉ的影响。结果显示：不同浓度的ＩＬ－２（１～２００Ｕ／ｍｌ）作用于原代培养的胚胎大鼠大脑皮层神经元６小时后其ＮＭＤＡＲ１ｍＲＮＡ表达量明显增加，并与ＩＬ－２浓度呈正相关关系。当其浓度为２５～２００Ｕ／ｍｌ时，ＮＭＤＡＲ１ｍＲＮＡ表达量增加４４．３％～２１９．７％（Ｐ＜０．０５）。ＩＬ－２（１～２００Ｕ／ｍｌ）与新生大鼠大脑皮层神经元共同孵育５～１０分钟后，［Ｃａ２＋］ｉ增加２７．１％～９４．２％（Ｐ＜０．０５）。钙通道阻断剂ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ可完全阻断ＩＬ－２引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高，而ＮＭＤＡ受体拮抗剂ＭＫ－８０１无此作用。本文结果提示：外源性ＩＬ－２具有兴奋性神经调质样作用，可能参与或介导了神经兴奋毒性作用和惊厥性疾病的发生与发展过程。     

雷公藤多甙对大鼠海马内注射β-淀粉样蛋白后星形胶质细胞增生的影响

目的：探讨大鼠海马内注射v淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)后海马星形胶质细胞表达GFAP的变化及雷公藤多甙(TWP)对其的影响。方法：在大鼠左侧海马定向注射Aβ1-40作为Aβ组，注射生理盐水作为对照组，雷公藤多甙腹腔注射治疗海马内注入了Aβ1-40的大鼠为TWP组。用免疫组织化学方法观察各组大鼠海马星形胶质细胞GFAP的表达。结果：Aβ组海马星形胶质细胞增生、肥大，GFAP阳性细胞数增多，细胞截面积明显增大。TWP组星形胶质细胞数较Aβ组减少，并且细胞截面积明显缩小。结论：雷公藤多甙能抑制Aβ诱导的海马星形胶质细胞的反应性增生。     

地塞米松和苯妥英钠对癫痫大鼠脑内的GFAP和Fos表达的抑制作用

目的：探讨糖皮质激素（GC）的抗痫效应和抗痫机制。方法：动物行为学观察和免疫细胞化学染色。结果：戊四氮（PTZ）可诱发癫痫大发作,如诺在注入PTZ前30min先注入地塞米松或苯妥英钠（DPH）能减轻或抑制大鼠癫痫发作症状。免疫细胞化学染色结果表明,PTZ致痫组大鼠大脑皮质、海马回、齿状有大量肥大的胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的星形胶质细胞。GC或DPH抗痫组GFAP免疫反应明显减弱,阳性细胞数量减少,突起短而少,Fos蛋白在PTZ组大鼠致痫后1－1．5h有大量表达,而在上述两抗痫组显著少于PTZ致痫组。结论：1．通过与苯妥英钠（传统抗痫药）的抗痫效果相比较,进一步证明糖皮质激素具有抗痫效应。2．糖皮质激素的抗痫机制可能与抑制星形胶质细胞的活动有关。3．Fos蛋白表达的变化与癫痫活动有直接关系。     

壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化

目的 建立多疣壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化方法.方法 分离孵化15d的多疣壁虎胚胎的大脑皮层,经胰酶消化,细胞计数后接种于培养瓶.采用差速贴壁及反复传代相结合的纯化培养方法培养胶质细胞;采用添加B27的神经元培养基培养神经元,并用免疫细胞化学方法鉴定.结果 获得体外培养的壁虎GFAP阳性表达胶质细胞,4代后纯度达95%以上;采用神经元培养基,神经元生长良好,NF、MAPⅡ表达阳性,第10d纯度达95%以上.结论 建立了壁虎细胞的培养方法,并获得高纯度的胶质细胞和神经元,为进一步对神经系统的深入研究提供细胞模型.     

携带酪氨酸羟化酶基因的质粒和逆转录病毒在大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞中表达效率的比较

目的　为提高体外转基因 (exvivo)治疗帕金森病大鼠模型的疗效 ,本实验拟比较两种基因表达载体介导的外源基因在两种不同运载细胞的瞬时表达效率。　方法　分别将酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组表达质粒和重组逆转录病毒导入原代培养的大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞 ,用免疫组织化学检测TH的表达效率 ;Westernblot法检测样品中TH特异性条带并转换成A值 ,以比较其在不同细胞中表达的相对含量。　结果　免疫组织化学检测表明 ,表达质粒的转染率为 5 %～ 7% ,逆转率病毒的感染率为 18%～ 2 0 % ;根据GDNF标准品蛋白条带含量与Westernblot结果的相应A值的标准曲线 ,推断出质粒转染和逆转率病毒感染的成纤维细胞中单个阳性细胞表达的TH相对平均含量分别为 4 76× 10 - 2 A和 4 35× 10 - 2 A ,质粒转染和逆转率病毒感染的脑胶质细胞分别是 5 4 5×10 - 2 A和 5 0 5× 10 - 2 A。　结论　不论是质粒载体还是逆转录病毒载体所携带的外源基因在两种细胞的单个阳性细胞中的表达无显著性差异。但由于逆转录病毒载体的感染率高于质粒载体 ,对于原代培养的成纤维细胞和脑胶质细胞 ,逆转率病毒载体是一种更好的表达载体。     

反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用

目的　构建反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞 (Ast)形态及GFAP基因表达的影响。　方法　用定向克隆技术 ,将 1.1kb的 GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体 p L XSN上 ,获得重组体 PL Bsk G,经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等 ,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养 ,收获病毒上清液感染体外培养的 Ast,通过免疫组织化学、原位杂交、RT- PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法 ,研究 PL Bsk G对正常及损伤 Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。　结果　插入PL Bsk G中的 GFAPc DNA片段序列、方向完全正确 ,Southern杂交及 RT- PCR分析表明 ,PL Bsk G成功整合入PA317细胞中 ,并实现了在 NIH3T3细胞中的表达。PL Bsk G使正常及反应性 Ast生长抑制 ,G1期阻滞 ,Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩 ,核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱 ;GFAP m RNA表达水平降低。　结论　获得了构建正确的反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,并证实其对正常及反应性 Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响 ,为深入研究 Ast反应及 GFAP基因的功能创造了条件。     

施万细胞对培养的神经干细胞存活及其分化的影响

目的：探讨施万细胞能否在体外促进神经干细胞的存活和分化。方法：分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞；同时获取从神经和臂丛神经，从中分离和纯化施万细胞。将施万细胞和神经干细胞进行共培养，借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞巢蛋白（nestin)的表达及其分化后神经丝蛋白（NF）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。应用扫描电镜观察神经干细胞的形态变化。结果：与施万细胞一起培养的神经干细胞存活数量增加，分为为神经元样细胞的数量也明显增加。这些神经元样细胞的初级突起比对照组的明显增长。施万细胞能使神经干细胞胞体表面不规则的凹凸变得平整。共培养的施万细胞和神经干细胞可以3种方式接触生长：1．胞体与胞体接触；2．胞体与突起接触；3．突起与突起接触。结论：施万细胞促进体外培养的神经干细胞的存活及其分化为神经元样细胞。     

胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠三叉神经节及三叉神经核团中的分布

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在成年大鼠三叉神经节及三叉神经核团内的分布，探讨其对三叉神经感觉神经元及运动神经元的作用。方法 抗GDNF多克隆抗体免疫组织化学ABC法。结果 成年大鼠三叉神经运动核、三叉神经感觉核簇及三叉神经节中出现GDNF免疫反应阳性。结论 成年大鼠三叉神经运动核、三叉神经感觉核簇及三叉神经节中存在GDNF神经元。     

低温对原代星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白和微丝的影响

用荧光染色方法，观察了低温（２～２２℃）对原代培养的星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）和微丝（ＭＦ）的影响。发现在低于２２℃中处理后，ＧＦＡＰ束和ＭＦ束变细，ＭＦ数量减少。处理时间越长，变化越明显。形态分化良好的细胞的ＧＦＡＰ束耐低温能力提高。结果表明，低温时ＧＦＡＰ束间联结断裂，而其本身无解聚；ＭＦ束间联结断裂，ＭＦ本身出现解聚。     

轴突成束和延伸蛋白ζ-1基因在1型和2型星形胶质细胞中的表达

目的 探讨轴突成束和延伸蛋白ζ-1(FEZ1)基因在1型和2型星形胶质细胞(T1A、T2A)中的表达差异,及其在新生SD大鼠中枢神经系统中的表达. 方法培养、分离、纯化T1A和T2A,提取总RNA,分别以Cy3-dCTP和cy5-dCTP标记T1A和T2A的mRNA,进行基因表达谱芯片检测分析.选取其中与轴突延伸相关的FEZ1基因,应用半定量RT-PCR法研究FEZ1在新生大鼠中枢神经系统多个部位的表达. 结果 T1A和T2A中差异表达基因138条,其中60条在T1A中高表达,78条在T2A中高表达.FEZ1基因在T2A中高表达.RT-PCR结果显示,FEZ1在新生大鼠中枢神经系统大脑皮层、嗅球和脊髓组织中均有表达. 结论 T1A和T2A中存在多个差异表达基因,其中与轴突延伸相关的FEZ1基因表达明显差异,提示T1A和T2A可能在诱导轴突生长方面有不同功能;FEZ1基因与中枢神经系统的发育和再生相关.     

大鼠侧脑室注射甘珀酸后下丘脑视上核星形细胞和神经元对高渗刺激反应的影响

目的 观察大鼠侧脑室注射甘珀酸后下丘脑视上核星形细胞和神经元对高渗刺激反应的影响。方法 经侧脑室注射缝隙连接阻断剂甘珀酸(carbenoxolone,CBX)及尾静脉注射9％NaCl溶液后，用放射性免疫分析法测定大鼠血浆中加压素(VP)含量，免疫组织化学方法观察下丘脑视上核(SON)神经元的：Fos和星形细胞的Fos以及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化。结果 1．未注射CBX组大鼠在高渗刺激后45min，血浆中VP的含量明显升高；SON中观察到GFAP／Fos阳性的星形细胞和Fos阳性神经元；2．GFAP／Fos阳性星形细胞高峰的出现早于Fos阳性神经元；3．向侧脑室注射CBX2h后，经尾静脉注射9％NaCl溶液，45Bin后血浆中的VP含量未升高，SON中GFAP／Fos阳性星形细胞的表达与未注射CBX组相同，Fos阳性神经元则显著减少。结论 SON的星形细胞对高渗刺激发生反应早于神经元，并可能通过缝隙连接影响神经元对渗透压的调节功能。     

GDNF在坐骨神经损伤后大鼠L4—6背根节神经元的表达及变化

目的 观察坐骨神经夹伤后不同时间点,胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）在成年大鼠Ｌ４～６背根节（ＤＲＧ）中的分布,探讨ＧＤＮＦ对感觉神经元损伤的反应。方法 成年大鼠右侧坐骨神经夹伤后,分别取伤后１、５、７、１０、１４、２８和５６ｄＬ４～６背根节,行抗ＧＤＮＦ多克隆抗体免疫组织化学ＡＢＣ法染色,之后对染色结果进行图像分析。结果 ＧＤＮＦ免疫反应存在于坐骨神经夹伤后１、５、７、１０、１４、２８和５６ｄ成年大鼠Ｌ４～６背根节神经元中,图像分析结果表明,伤后１、３、５和７ｄ的损伤侧背根节神经元的平均光密度大于对照侧背根节神经元。结论 大鼠坐骨神经夹伤后,ＧＤＮＦ在背根节Ｌ４～６感觉神经元中有一定量的变化,且伤后１周内ＧＤＮＦ在伤侧背根节神经元中的表达增强。