免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选，并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆PET－28a( )表达载体，IPTG诱导表达后用SDS－PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87；成功构建重组表达质粒PET－28a( )/Ts87。诱导表达该融合蛋白，SDS－PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白，与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87，与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应，PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。     

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

旋毛虫原肌球蛋白的特性分析及原核表达北大核心CSCD

目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)特性并制备重组旋毛虫TM蛋白。方法 在NCBI的Nucleotide数据库选取旋毛虫TM (GenBank:AF419300.1),利用在线分析工具分析旋毛虫TM的氨基酸组成、二级/三级结构、疏水性等特性。密码子优化后合成旋毛虫TM(GenBank:AF419300.1)的全长并插入到原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-TM,转化至BL21(DE3)中,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导旋毛虫TM的表达,纯化后采用Western blot法对重组旋毛虫TM蛋白进行鉴定。结果 旋毛虫TM为亲水性不稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,无复杂的空间结构。构建的重组原核质粒pET-28a(+)-TM经双酶切得到867 bp的基因片段,序列测定后证实重组原核质粒pET-28a(+)-TM构建正确。经IPTG诱导的菌体超声混悬液、离心后上清均检测到相对分子质量约40×10~3的目的蛋白,纯化后得到条带单一的旋毛虫TM。Western bolt显示纯化的重组旋毛虫TM具有良好的反应原性,能被相应抗体识别。结论 获得具有反应原性的纯化的重组旋毛虫TM,该蛋白为亲水性不稳定蛋白,无复杂空间结构,为进一步研究旋毛虫TM蛋白的生物学功能奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的 在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3．1／Ts87，为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础。方法 将重组质粒pcDNA3．1／Ts87：经脂质体Lipofectamine介导，体外转染真核细胞COS7，通过细胞免疫组化，细胞裂解物的SDS—PAGE电泳和Western—blot分析检测表达产物。结果 重组质粒能够在COS7中表达出约38ku的目的蛋白，并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。结论 构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达。     

两种纯化幽门螺旋杆菌VacA-HpaA融合蛋白包涵体方法的比较

目的比较Ni^2＋-NTA树脂和切胶纯化重组VacA-HpaA融合蛋白的纯化效果,探讨纯化蛋白包涵体的简易方法。方法克隆并表达重组pQE30-vacA-hpaA-DH5α工程菌,获得重组VacA-HpaA融合蛋白的包涵体,分别进行Ni^2＋-NTA树脂和切胶纯化,获得可溶性重组蛋白,Western blot鉴定其抗原性;用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗VacA、HpaA和VacA-HpaA的IgG水平,鉴定其免疫原性。结果两种方法均能纯化重组VacA-HpaA融合蛋白包涵体,得到可溶性的重组蛋白,Ni^2＋-NTA树脂纯化法获得的可溶性重组蛋白的纯度为95.8%,得率为63.5%;切胶纯化法获得可溶性重组蛋白的纯度为93.3%,得率为75.2%。Western blot鉴定纯化蛋白均具有良好的抗原性。ELISA法检测显示小鼠血清均能与重组蛋白VacA、HpaA和VacA-HpaA发生反应,两组IgG水平比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,均具有良好的免疫原性。结论切胶纯化重组VacA-HpaA融合蛋白包涵体是一种简单、经济的可行方法,有利于重组蛋白包涵体的纯化。     

抗人红细胞单链抗体与狂犬病毒G蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

摘要：目的 为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白。方法 本研究利用特异性引物从重组质粒pMD-2E8ScFv和pMD-G中以PCR方法扩增2E8基因（抗人红细胞H抗原单链抗体基因）和Kg基因(狂犬病毒G基因主要抗原表位区),采用重叠延伸（SOE）PCR法拼接成融合基因2E8Kg,构建原核表达质粒pET-Trx-2E8Kg并将其转化至BL21（DE3）plysS中进行诱导表达并对诱导菌液进行SDS-PAGE分析。结果 2E8Kg融合基因获得了高效表达并主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的23.5%左右,分子量约为77.7kD,与预期的大小一致。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达到98.9%。结论 经Western-blot检测和红细胞凝集试验证明,2E8kg融合蛋白既能够与狂犬病毒（RV）高免血清发生特异性反应,又能够与人红细胞结合,具有双功能特性。     

Production and characterization of recombinant chicken insulin-like growth factor-I from Escherichia coli.

Recombinant chicken insulin-like growth factor-I (cIGF-I) has been produced in Escherichia coli after first modifying a plasmid that coded for a human IGF-I (hIGF-I) fusion protein, in order to introduce codons for the eight amino acid substitutions. The cIGF-I fusion protein, deposited in bacterial inclusion bodies, was dissolved under reducing conditions, desalted, subjected to anion-exchange chromatography to remove proteinases, refolded and partially purified by reverse-phase high-performance liquid chromatography. The fusion protein was cleaved with hydroxylamine after which cIGF-I was purified to homogeneity by three additional chromatographic steps. Recombinant cIGF-I was equipotent with hIGF-I in cell culture bioassays of protein synthesis and breakdown using rat L6 myoblasts and chick embryo fibroblasts. Binding of radiolabelled cIGF-I and hIGF-I was also equivalent in the two cell lines, as was their binding in ligand blots of chicken, sheep and human plasma. The cross-reactivity of cIGF-I in a polyclonal hIGF-I radioimmunoassay was 60% of that observed with hIGF-I. The availability of recombinant cIGF-I will facilitate investigations into the role of IGF-I in chicken growth and development.     

Production, in vitro characterisation, in vivo clearance, and tissue localisation of recombinant barramundi (Lates calcarifer) insulin-like growth factor II

Recombinant barramundi insulin-like growth-factor-II (bIGF-II) has been produced in Escherichia coli after modification of an expression plasmid that coded for a chicken IGF-II fusion protein. The bIGF-II fusion protein, deposited in bacterial inclusion bodies, was dissolved under reducing conditions, desalted, and refolded. The protein was then released from the fusion protein by cleavage with subtilisin BPN'. Finally the protein was purified to homogeneity with a number of HPLC steps. In vitro analysis of recombinant bIGF-II demonstrated decreased potency in stimulating protein synthesis when compared to human and barramundi IGF-I (bIGF-I). The in vivo distribution of radiolabeled bIGF-II and bIGF-I in the circulation and tissue uptake of radiolabeled bIGF-II was also compared in juvenile barramundi (Lates calcarifer). Analysis of trichloroacetic acid-precipitable radioactivity in sequential samples following bolus injection of radiolabeled IGFs revealed that bIGF-II was degraded faster than bIGF-I. Moreover, neutral gel chromatography of these samples suggested this difference may be due to reduced affinity of bIGF-II, compared to blGF-I, for the IGF-binding proteins (IGFBPs) present in the barramundi circulation. Based on these results, it would appear that elements important in the function of IGFs have been well conserved during vertebrate evolution. However, to clearly define the IGF system in fish it will be necessary to characterise the IGFBPs present and to determine how they influence the biological actions of native IGFs.     

重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y2重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y2融合蛋白.重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y2在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

Purification and molecular characterization of recombinant rat betacellulin

A method for the large scale expression and purification of rat betacellulin (BTC) from Escherichia coli has been developed using a cleavable fusion protein strategy. Insoluble fusion protein collected as inclusion bodies was dissolved in urea under reducing conditions, re-folded, and purified by gel filtration chromatography and C(4) RP-HPLC. Authentic rat BTC was obtained after proteolytic cleavage of the fusion protein with Factor Xa. Factor Xa cleaved an additional site within the BTC protein, generating a truncated isoform separable from full-length BTC by heparin-affinity chromatography. Recombinant rat BTC stimulated the proliferation of mouse Balb/c 3T3 fibroblasts and competed for binding to the ErbB1 receptor in a dose-dependent manner analogous to that of BTC purified from natural sources.     

一种获得高纯度包涵体蛋白的简便方法

以日本血吸虫SjBMP基因部分编码序列构建SjBMP-pET-28a(+)重组原核表达质粒,并转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达。将经过鉴定的目的蛋白rSjBMP以包涵体形式表达的诱导菌样通过Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)切胶再纯化。用该纯化蛋白制备免疫血清,用蛋白质印迹(Western blotting)检测其免疫反应性。结果显示,经Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和SDS-PAGE切胶再纯化,获得高纯度的目的蛋白,回收率>11.0%。用该纯化蛋白免疫家兔制备免疫血清,获得的血清效价高于1∶1 280;Western blotting检测结果表明,用该免疫血清去识别表达的重组蛋白,出现特异的单一条带,表明该纯化蛋白仍保持其抗原性,可用于免疫学相关实验研究。因此,SDS-PAGE切胶纯化后电渗、透析回收是纯化重组包涵体蛋白有效、简便的方法。     

日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/26GST)的免疫原性鉴定

目的：鉴定纯化的重组日本血吸虫线粒体相关融合蛋白（rSj338/26GST）的免疫原性。方法：对已构建的阳性表达菌pGEX-6p-1/Sj338进行大量诱导表达，并对纯化蛋白进行活性分析。将粗提包涵体蛋白、复性包涵体蛋白、经分子筛纯化并复性的蛋白分别免疫新西兰家兔2只。用Western blot及Dot-ELISA方法检测特异性抗体的免疫原性及各组抗体水平。结果：用分子筛纯化的融合蛋白rSj338/26GST经SDS－PAGE电泳鉴定显示达电泳纯；Western blot显示纯化蛋白能够被日本血吸虫重感染兔血清及rSj338/26GST免疫兔血清识别。Dot-ELISA法检测结果表明，经分子筛纯化并复性的rSj338/26GST融合蛋白免疫兔血清中特异性抗体的滴度最高，为1：51200。结论：纯化后的融合蛋白rSj338/26GST具有较高的纯度及较强的免疫活性，可望作为日本血吸虫病疫苗候选分子，值得进一步深入研究。