pEGFP-N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的:构建pEGFP-N 1 Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达.方法:利用RT-PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序(重组质粒双酶切后与pEGFP-N 1真核表达载体连接,构建pE(;FP-N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功.分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N 1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT-PCR检测Snail在该细胞中表达.结果:本实验成功构建了pEGFP-Nl-Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达.结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础.     

癌胚抗原基因真核表达载体的构建

目的：克隆人癌胚抗原（CEA）基因cDNA,构建pcDNA3．1-CEA真核表达载体。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术,从人结肠癌细胞组织克隆出CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcD—NA3．1真核表达载体上,构建成pcDNA3．1-CEA重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增,发现2.1kb的目的基因条带、双酶切电泳分析可见2．1kb的目的基因条带和5．4kb的载体条带、单酶切电泳分析可见0．9kb的条带和6．6kb的条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同。结论：本实验成功地克隆了CEA基因并构建了其真核表达质粒,为进一步研究CEA真核表达载体抗肿瘤的实验打下基础。     

人釉原蛋白编码区基因原核表达载体的构建

目的：构建人釉原蛋白（amelogenin，AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。方法：运用TA克隆技术。将AMG基因片断插入质粒pMD18-T，通过BamHⅠ和X幻Ⅰ双酶切后。T4 DNA连接酶连接目的基因AMG与原核表达质粒pGEX-4T—1，最终获得重组原核表达载体pGEX-4T—1/AMG。结果：对重组质粒pMD 18-T／AMG和pGEX-4T-1，AMG进行酶切和测序鉴定，酶切电泳图和测序结果与预期结果一致。结论：成功构建了人釉原蛋白（AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。     

犬IGF-I编码区cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆犬胰岛素样生长因子(IGF—Ⅰ)编码区基因，构建重组真核表达载体。方法：从犬左心室组织中提取总RNA，通过RT—PCR获取IGF—1 cDNA编码区全序列，将其与pcDNA3．1( )质粒载体连接，构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1，转化大肠杆菌DH5α后，随机挑选数个克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pcDNA3．1( )／IGF—1的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到IGF—1编码区基因，成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1。     

人共刺激分子B7-H3表达载体的构建及表达检测

目的：B7-H3作为B7家族的最新成员，其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达，B7-H3对CD4＋和CD8＋细胞的生成均具有增加作用，并可选择性增加IFN-γ的生成。为将B7-H3基因转染入舌鳞癌细胞Tea8113中制备瘤苗。克隆人共刺激分子B7-H3基因，构建其真核表达载体，并检测B7-H3基因在Tea8113中的表达。方法：从淋巴细胞中提取RNA，用RT—PCR方法将B7-H3的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP—C1中，构建成最终的表达载体pEGFP—C1-B7-H3。运用脂质体方法将pEGFP—C1-B7-H3转染Tea8113细胞．转染24h后．荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，RT—PCR检测B7-H3在该细胞中的表达。结果：从淋巴细胞中提取的RNA质量较好，经RT—PCR扩增出目的基因B7-H3，其全长大小为951bp。测序鉴定，该序列与GenBank中序列相同。转染pEGFP—C1-B7-H3载体的靶细胞Tea8113中，荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白，RT—PCR方法检测到目的基因B7-H3的-个215bp大小的eDNA扩增产物。结论：酶切及RT—PCR证实成功构建人B7-H3的真核表达载体pEGFP—C1-B7-H3，将该载体转染到Tea8113中，RT—PCR鉴定B7-H3基因在该细胞中表达。     

人共刺激分子4—1BBL表达载体的构建及转染Tca8113细胞的研究

目的：克隆人肿瘤坏死因子配体超家族tumor necrosis factor superfamily，TNFSF）成员4—1BBL基因，构建其真核表达载体，并检测4—1BBL基因在Tca8113中的表达。方法：从淋巴细胞中提取RNA，用RT—PCR方法将4—1BBL的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP—C1质粒中，构建成最终的表达载体DEGFP—C1—4—1BBL。运用脂质体方法将pEGFP—C1—4—1BBL转染Tca8113细胞，转染24h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达．RT—PCR和免疫印迹检测4—1BBL在该细胞中的表达。经G418筛选后。用有限稀释法建立稳定高表达的带有4—1BBL基因的Tca8113细胞系。结果：从淋巴细胞中提取的RNA经RT—PCR扩增出目的基因4—1BBL，其全长大小为768bD。测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染pEGFP—C1—4—1BBL载体的靶细胞Tca8113中．荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白，RT—PCR方法检测到目的基因4—1BBL的768bp大小的cDNA扩增产物。裂解的4—1BBL／rca8113基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约27．5Kd的特异性条带。结论：转染4—1BBL基因细胞株的建立．为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白- 2（hBMP2）基因片段,构建pcDNA3.1- hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白- 2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1- hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2- cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。     

釉成熟蛋白真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建釉成熟蛋白真核表达载体peDNA3.1-Amelotin,并观察其在293T细胞中的表达情况.方法:以出生后6d的昆明小鼠下颌磨牙中提取的总RNA为模板,设计合成特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠的釉成熟蛋白[Amelotin(GenelD:71421)],包括编码区全长在内的部分cDNA序列,克隆到pMD18-T克隆载体,酶切鉴定正确;然后亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定及测序正确.将构建的重组载体磷酸钙法转染293T细胞,检测Amelotin的表达情况.结果:成功克隆了Arnelotin基因编码区全长序列;构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,磷酸钙法转染后可检测到Amelotin基因在293T细胞中的表达.结论:构建了重组pcDNA3.1-Amelotin真核表达载体,并成功表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性奠定了基础.     

重组真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂（rhIL-1ra）基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,为使用细胞因子拮抗剂基因治疗牙周炎奠定实验基础。方法Trizol法提取人乳腺癌组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的基因。胶回收、纯化后产物与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序鉴定正确后将重组克隆载体与真核表达质粒pEGFP-N1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,体外连接。重组DNA转化感受态细菌E.coliTOP10,筛选阳性克隆并鉴定。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA由脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选20d,RT-PCR检测基因的表达,ELISA检测蛋白的表达。结果重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra经PCR及双酶切鉴定均证实人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。稳定转染NIH3T3细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功构建了编码人IL-1ra基因的重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的后续研究奠定了实验基础。     

hrCEMP1真核表达载体的构建及其在成纤维细胞株中的表达

目的：构建含hrCEMP-1基因真核表达质粒。方法：采用PCR方法扩增hrCEMP1基因,并在两端添加合适的酶切位点;利用定向克隆技术将hrCEMP1基因插入到载体pcDNA3.1中,重组的pcDNA3.1-CEMP1在大肠杆菌DH5α内扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建成功;利用高效率的阳离子聚合物,将经过鉴定的pcDNA3.1-CEMP1转染入NIH3T3细胞中,并以RT-PCR检测hrCEMP1基因的转录。结果：通过对重组质粒pcDNA3.1-CEMP1进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-CEMP1构建成功,开放阅读框架正确;转染细胞株的RT-PCR结果中观察到特异性242bp片段。结论：成功构建含hrCEMP-1基因真核表达质粒pcDNA3.1-CEMP1,并可在NIH3T3细胞株中mRNA水平表达。     

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的 构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系.方法 采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体...     

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A（MICA）的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。     

上皮膜蛋白1真核表达载体的构建及其对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 构建上皮膜蛋白1（EMP1）基因真核表达载体pEGFP-N1-EMP1,探讨EMP1基因对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响。方法 采用逆转录聚合酶链式反应（PCR）扩增EMP1基因,双酶切法连接至真核表达载体pEGFP-N1双酶切产物大片段,构建pEGFP-N1-EMP1重组质粒。经测序鉴定后,通过脂质体介导法将pEGFP-N1-EMP1重组质粒和pEGFP-N1空载体转染至人舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞,荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR法检测转染后24、48、72 h的EMP1过表达水平。利用Transwell迁移及侵袭实验分析EMP1过表达对Tb3.1细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 成功克隆EMP1全长基因,经测序分析证实将EMP1基因准确插入真核表达载体pEGFP-N1,转染后细胞可见绿色荧光表达。实时荧光定量PCR结果显示,pEGFP-N1-EMP1重组质粒转染24 h组,Tb3.1细胞中EMP1表达量显著高于pEGFP-N1空载体组、野生型细胞组以及重组质粒转染48 h和72 h组。Transwell迁移及侵袭实验结果显示,EMP1过表达抑制了Tb3.1细胞的迁移和侵袭能力。结论 成功构建了EMP1真核表达载体,并在体外证实了EMP1过表达可抑制舌鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力,为进一步研究EMP1基因在口腔鳞状细胞癌转移中的作用及其分子机制奠定了基础。     

TRAF-6真核表达载体的构建和转染牙龈上皮细胞

目的:构建TRAF-6与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,为研究其在口腔疾病发病中的作用奠定基础。方法:应用基因重组技术,将反转录PCR得到的TRAF-6基因,克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经HindⅢ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定。重组质粒酶切鉴定正确后,以脂质体转染牙龈上皮细胞。分别由间接免疫荧光和免疫组织化学检测目的蛋白的表达。结果:获得的TRAF-6基因重组真核表达质粒,经间接免疫荧光和免疫组化检测,TRAF-6成功转染上皮细胞。结论:成功克隆TRAF-6基因,构建了融合有TRAF-6基因的真核表达质粒,对其在体外进行了表达,并转染牙龈上皮细胞,为进一步的研究奠定了基础。     

TK基因重组质粒的构建及在ACC-2细胞中的表达

目的：克隆胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因，构建质粒表达载体pIRES—TK，并利用该载体转染ACC-2细胞，建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞克隆。方法：通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX—TK中扩增出TK基因全长序列，将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中，构建重组表达载体pIRES—TK，用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞，经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株，提取该细胞株的总RNA，用RT—PCR检测TK基因的表达。结果：PCR扩增出1128 bp大小的片段，测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致；阳性重组质粒pIRES—TK经XhoI和Mull双酶切后获得2692 Bb和1128 bp的片段；RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361 bp的预期片段。结论：成功扩增了TK基因的DNA片段；成功构建了质粒表达载体pIRES—TK；建立了稳定表达TK基因的ACC～2细胞株，为TK／GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础。     

采用酵母表达载体pWX530构建表达人重组牙骨质蛋白1

目的：构建含人重组牙骨质蛋白1（recombination human cementum protein 1,rhCEMPl）基因的真核表达载体,观察其在酿酒酵母细胞中的表达。方法：采用PCR方法扩增rhCEMPl基因,利用定向克隆技术将rhCEMPl基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMPl在大肠杆菌DH5a中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。经鉴定正确的表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。结果：构建的重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS—PAGE和ELISA检测rhCEMPl表达成功。结论：成功构建的含m—CEMPl基因的真核表达载体pWX530-rhCEMPl,并能转入酵母细胞中成功表达。     

稳定过表达成纤维细胞激活蛋白的口腔鳞状细胞癌细胞株的构建

目的 构建人成纤维细胞激活蛋白（FAP）过表达慢病毒载体,转染口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞株SCC9,构建稳定过表达FAP的OSCC细胞株。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术获得FAP片段,利用基因重组技术构建过表达FAP的慢病毒载体,包埋病毒并收集上清液感染SCC9细胞株,通过流式细胞荧光分选技术（FACS）进行筛选,获得稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结果 对阳性克隆进行酶切鉴定和基因测序证明FAP的慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果证明成功构建稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结论 本研究有助于获得纯化FAP蛋白,为进一步研究FAP在OSCC发生发展过程中的机制奠定基础。     

鲑鱼降钙素重组杆状病毒载体的构建及表达

目的：利用昆虫细胞杆状病毒系统表达重组鲑鱼降钙素（recombinant salmon Calcitonin，rsCT），探索一条真核生物表达生物活性rsCT的新途径。方法：将鲑鱼降钙素基因重组到pFastBac杆状病毒穿梭载体（baculovirus shuttle vector，Bacmid）中，构建重组鲑鱼降钙素杆状病毒表达载体即重组鲑鱼降钙素Bacmid，后将其转染昆虫细胞Sf9，表达目的蛋白，并对表达产物进行分子量及免疫反应性鉴定。结论：证实目的基因在昆虫细胞中获得了表达。结论：成功构建了鲑鱼降钙素重组杆状病毒载体并在昆虫细胞中初步表达。     

低氧诱导因子-1α慢病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞内表达的检测

目的:构建低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的慢病毒载体(Lenti-HIF-1α),转染骨髓基质干细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)后,检测HIF-1α在BMSCs内的表达,并鉴定其位置。方法:根据人的HIF-1α基因(NM_001530)序列行引物设计及序列片段的PCR扩增,将目的基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α。将目的基因PCR产物和目的载体用NheI和BamHI分别进行酶切,对质粒进行鉴定。采用LR重组系统将目的序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-HIF-1α(Lenti-LacZ为对照组)。检测慢病毒滴度后,转染BMSCs,检测目的基因的表达。通过细胞免疫组织化学法观察HIF-1α在BMSCs内的位置。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α构建成功。用Lenti-HIF-1α转染BMSCs细胞,0、1、4、7、14和21 d后qPCR检测。结果表明HIF-1α在转染后的第4天开始有明显的过表达,且持续到第21天。细胞免疫组织化学结果显示目的基因位于BMSCs的核内。结论:成功构建了慢病毒载体Lenti-HIF-1α,且转染的目的基因位于BMSCs细胞核内,为HIF-1α介导的BMSCs进行体内实验研究奠定了基础。     

NRP-1在调控人舌鳞状细胞癌细胞分化中的作用

目的:构建神经纤毛素1(Neuropilin-1,NRP-1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对人舌鳞状细胞癌细胞株SCC25(squamous cell carcinoma 25)分化的影响。方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰NRP-1编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1。将构建正确的PL-KO.1/NRP-1-shRNA感染SCC25,western blot和实时荧光定量PCR检测NRP-1的表达,划痕实验和实时荧光定量PCR检测其对SCC25分化的影响。结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,SCC25转染了NRP-1-shRNA后NRP-1表达水平降低,干扰效率达65%。划痕实验结果表明NRP-1下调明显降低了SCC25的迁移能力。实时荧光定量PCR结果表明NRP-1下调可以导致SCC25上皮标记蛋白钙粘附蛋白(epi-thelial cadherin,E-cadherin)表达上调,而间充质标记蛋白纤粘蛋白(fibronectin,FN)和波形蛋白(Vimentin,VIM)表达下调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论:慢病毒介导的NRP-1-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响SCC25的分化。