JAK2/STAT3信号通路介导大鼠血管平滑肌细胞的增殖与凋亡

目的研究大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、凋亡与信号传导子和激活子3(STAT3)信号传导通路的关系,明确以JAK2/STAT3为靶向的信号传导在VSMCs中的分子调控机制。方法将酪氨酸激酶(JAK2)抑制剂AG490,作用于大鼠VSMCs,运用MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测VSMCs凋亡;W estern b lot检测JAK2、STAT3、cyc lin D1、BCL-2的表达及相关蛋白磷酸化活性。结果AG490呈时间、剂量依赖性方式抑制VSMCs增殖,促进其凋亡。P-JAK2、P-STAT3、cyc lin D1、BCL-2表达水平随作用时间延长而下降(P<0.01)。结论癌基因STAT3信号传导通路调控了AG490对VSMCs作用的细胞内信号传导机制,最终通过其下游靶基因cyc lin D1、BCL-2影响VSMCs的增殖与凋亡。     

JAK/STAT通路调节IL-4诱导的肝星状细胞I型胶原基因的表达

 目的：探讨JAK/STAT通路在IL-4对肝星状细胞(HSC)中I型胶原基因表达的影响及其作用机制。方法 用RT-PCR法和ELISA法分别检测不同浓度IL-4对人肝星状细胞系LX-2 中I型胶原mRNA表达和蛋白合成的影响;用Western blot法和RT-PCR法分别观察JAK1抑制剂AG490对IL-4诱导的JAK1磷酸化以及I型胶原mRNA表达的影响;用Western blot法和RT-PCR法分别观察LX-2转染STAT6-ASON对IL-4诱导的STAT6磷酸化以及I型胶原mRNA表达的影响。结果 IL-4诱导LX-2中I型胶原mRNA表达及其蛋白的合成,呈现剂量依赖性效应;AG490完全阻断IL-4诱导的JAK1磷酸化和I型胶原mRNA的表达;LX-2转染STAT6-ASON完全阻断IL-4诱导的STAT6磷酸化和I型胶原mRNA的表达。结论 JAK/STAT信号传导通路参与调节IL-4诱导HSC 中I型胶原基因表达,并在肝纤维化发生过程中发挥重要的作用。     

JAK2抑制剂对食管癌细胞增殖、凋亡及COX-2表达的影响

目的 研究食管癌细胞Eca-109增殖、凋亡及COX-2表达与信号转导子和激活子3（STAT3）信号传导通路的关系，明确以JAK2/STAT3为靶向的信号转导在Eca-109细胞中的分子调控机制。方法 将JAK2抑制剂AG490作用于Eca-109细胞，用MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪、DNA琼脂糖电泳法及透射电子显微镜检测细胞凋亡；Western blot法检测细胞中JAK2、p-JAK2、p-Stat3及COX-2的蛋白表达变化；RT-PCR 检测COX-2 mRNA的变化。结果 AG490呈时间、剂量依赖性的抑制Eca-109细胞增殖并诱导凋亡，抑制JAK2/STAT3通路蛋白的表达，呈浓度依赖性地下调p-JAK2及p-Stat3蛋白的表达（P <0.05），并下调COX-2 mRNA及蛋白的表达（P <0.05）。结论 JAK2/STAT3信号传导通路调控AG490对Eca-109细胞作用的细胞内信号传导机制，最终通过下调COX-2表达影响Eca-109细胞的增殖并诱导凋亡。     

流体剪切应力对人脐静脉内皮细胞Pim-1基因表达的影响

目的　探讨流体剪切应力对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Pim-1基因表达的影响及可能的信号机制。 方法　酶消化法分离健康产妇新鲜脐静脉获取原代HUVECs,应用平行平板流动腔系统给HUVECs加载不同时间（1、4、6 h）和不同大小（0.5、1.5、3.0 Pa）的层流剪切应力,用实时定量RT-PCR检测Pim-1基因的表达水平,用蛋白质印迹法检测p-Akt和p-STAT3的表达水平,利用Wortmannin (PI3K抑制剂)、 Deguelin (Akt抑制剂) 和AG490 (JAK抑制剂) 信号阻断剂探讨信号转导途径。 结果　HUVECs在1.5 Pa 剪切应力作用4 h后Pim-1基因表达明显增加。不同强度的切应力均会刺激Pim-1基因的表达,其中3.0 Pa表达最强。切应力能显著激活p-Akt和p-STAT3的表达。AG490可以明显抑制Pim-1的表达,而Wortmannin和Deguelin增强Pim-1的表达。 结论　流体剪切应力可诱导HUVECs中Pim-1基因表达,其表达量与刺激时间和剪切应力的强度密切相关,这种作用可能通过JAK/STAT3和PI3K/Akt信号通路调节。     

胚胎血管发育早期PDGF-BB对血管平滑肌细胞趋化的影响

目的：建立胚胎血管发育早期血管平滑肌细胞（VSMCs）趋化模型，并观察胚胎血管发育早期血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）对VSMCs趋化的影响。方法：采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体，然后接种于under-agarose凝胶作为平滑肌细胞趋化模型。用慢速视频显微摄像技术观察拟胚体分化后表达GFP的VSMCs，分析比较不同浓度PDGF-BB对VSMCs分化和移行的影响。结果：在under-agarose凝胶中，拟胚体在无外源性生长因子存在的条件下可自发向心肌细胞、内皮细胞和VSMCs分化。拟胚体贴壁分化20 d时，对照组及4 种浓度PDGF-BB（5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L）组VSMCs的平均迁移速率分别为（94.07±23.80）μm/h、（118.08±31.63）μm/h、（173.53±24.58）μm/h、（380.74±39.56）μm/h和（335.62±32.16）μm/h，峰值浓度为20 μg/L。经浓度大于10 μg/L PDGF-BB处理后，VSMCs向PDGF-BB孔方向移行，对照组、低浓度PDGF-BB组VSMCs呈不规则性迁移。结论：该模型能够模拟胚胎血管发育早期全过程，可用于研究不同生长因子对VSMCs趋化的影响。外源性PDGF-BB能定向诱导胚胎血管发育早期VSMCs迁移，其定向趋化作用在一定浓度范围内呈量效关系。     

AG490在人膀胱癌细胞株Pumc-91中STAT3的抑制作用

目的 研究不同孵育时间以及不同浓度的STAT3特异性抑制剂AG490作用于人移形上皮膀胱癌细胞株(pumc-91)中STAT3信号通路蛋白表达的条件优化.方法 分别在0、24、36、48、60h收集细胞并提取细胞蛋白,应用Western Blot对各组中STAT3的蛋白表达水平进行半定量分析;加入100μmol/L AG490作用于pumc-91细胞,分别用0、50、100、200μmol/L的AG490处理pumc-91细胞48h后,应用Western Blot检测各组中STAT3的蛋白表达水平.结果 STAT3蛋白的表达随AG490作用时间延长而逐步降低,在作用时间为48h时,差异有统计学意义(P＜0.05).STAT3蛋白的表达明显随AG490浓度的升高而逐步下降,在浓度为200μmol/L时差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 AG490通过抑制STAT3蛋白的表达,成功抑制了STAT3信号通路的活性,而且其抑制作用具有时间和剂量的依赖性,AG490在作用浓度为200μmol/L和作用时间为48h的条件下,有效的抑制了STAT3蛋白在pumc-91细胞系中的表达.     

HMGB1对大鼠类纤维母细胞样滑膜细胞STAT/SOCS/cyclin D1表达的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白(HMGB)1对大鼠滑膜细胞STAT/SOCS信号通路的调控作用。方法: 将常规培养大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞随机分为正常对照组和10 μg/L HMGB1刺激组,分别培养6 h、12 h和24 h后,RT-PCR检测STAT 1/3 mRNA的表达,Western blotting法检测磷酸化STAT（p-STAT）1/3和STAT 1/3蛋白的表达,流式细胞术（FCM）检测p-STAT 1/3、SOCS 1/3和cyclin D1蛋白的表达。 结果: HMGB1呈时间依赖性上调STAT1 mRNA和蛋白的表达,以及cyclin D1蛋白的表达,并能明显增加p-STAT 1的水平（P＜0.01）,但STAT3的表达以及p-STAT3的量与对照相比无明显差异。HMGB1刺激后还能明显增加细胞SOCS1的蛋白水平,但SOCS3蛋白仅于6 h呈一过性增高。 结论: HMGB1能激活STAT1信号转导通路,并上调cyclin D1基因表达,这可能与HMGB1促进滑膜细胞的增殖有关。     

AG490对HEL细胞VEGF和HIF-1α表达的影响

 目的: 探讨JAK2抑制剂AG490对人红白血病(HEL)细胞迁移及对VEGF和HIF-1α表达的影响。方法: 用不同浓度的AG490处理HEL细胞,CCK-8法检测细胞活力,Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡及周期,Transwell小室检测细胞迁移能力,RT-PCR检测JAK2的mRNA水平,Western blot检测p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平。结果: AG490能够抑制HEL细胞的活力,不同浓度(20、40、60、80和100 μmol/L)AG490作用HEL细胞48 h后,细胞活力分别为88%、75%、48%、10%和0.12%(P<0.05);Hoechst 33342凋亡细胞染色显示80 μmol/L AG490处理细胞48 h后,亮蓝色凋亡细胞较对照组明显增多(P<0.05);流式结果显示80 μmol/L AG490作用细胞48 h后,凋亡率上升;细胞迁移实验结果显示20 μmol/L AG490处理细胞24 h后漏出细胞明显低于对照组(P<0.05);RT-PCR结果显示不同浓度AG490处理HEL细胞48 h后JAK2 mRNA呈剂量依赖性减低;Western blot结果显示实验组细胞的p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平较对照组明显减低(P<0.05)。结论: AG490可通过抑制JAK2信号通路,抑制HEL细胞血管新生因子VEGF和HIF-1α的表达。     

Caveolin-1蛋白及ERK1/2信号转导途径在17β-雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 研究caveolin-1蛋白及细胞外信号调节激酶（ERK1/2）在17β-雌二醇（E2）抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖中的作用。方法：在培养的VSMCs上,采用［3H］-TdR掺入法、Western blotting观察E2预处理前后血清（FCS）对VSMCs DNA合成及caveolin-1、MKP-1、磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响,同时采用RT-PCR技术观察caveolin-1 mRNA的变化。结果：E2作用24 h,可明显抑制FCS诱导的VSMCs增殖。RT-PCR及Western blotting结果显示,FCS可抑制caveolin-1 mRNA及蛋白表达,而E2预处理可增加其表达。同时,Western blotting结果还提示,E2预处理可增加MKP-1蛋白表达,抑制ERK1/2蛋白表达。结论：E2可通过增加caveolin-1及MKP-1蛋白表达,抑制磷酸化ERK1/2活性,促进其降解,来抑制VSMCs增殖。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞组织因子表达增强

目的: 研究同型半胱氨酸（Hcy）诱导人血管平滑肌细胞（VSMCs）组织因子（TF）表达的作用，及其对核转录因子（NF-κB）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。 方法: 培养人脐动脉VSMCs，将不同浓度的Hcy和/或NF-κB抑制剂PDTC与VSMCs孵育不同时间，用RT-PCR方法检测TF mRNA表达，用Western blotting检测核NF-κB水平，用流式细胞术（FCM）检测细胞表面TF蛋白水平和iNOS水平。 结果: 10 μmol/L Hcy作用4 h，TF表达开始升高，500 μmol/L达峰值，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF mRNA；对照组VSMCs细胞膜表面有低水平的TF蛋白表达，10 μmol/L Hcy作用4 h即可诱导VSMCs表达TF蛋白，500 μmol/L 达高峰，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF；500 μmol/L Hcy作用1 h，细胞核NF-κB水平明显升高，Hcy可诱导VSMCs NF-κB活化;NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制Hcy对TF mRNA和细胞TF表达的诱导作用；单独Hcy作用不能诱导VSMCs表达iNOS。 结论: Hcy能显著诱导VSMCs表达TF，增强VSMCs的NF-κB活化，从而介导TF基因表达和蛋白合成，通过NF-κB介导VSMCs表达TF可能是Hcy导致AS、血栓形成的重要机制。     

SHIP1调控STAT3信号通路对白血病Jurkat细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP1)通过调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对人白血病细胞活力和凋亡的影响。方法:以白血病Jurkat细胞为研究对象,将转染空载体和SHIP1过表达载体的细胞分别记为阴性对照(NC)组和SHIP1组,同时以不作处理的细胞为空白对照(control)组,用real-time PCR和Western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白水平。同时,用STAT3信号通路抑制剂AG490作用于control组和SHIP1组细胞,分别记为control+AG490组和SHIP1+AG490组,再观测上述指标的变化。结果:分别与control组和NC组比较,SHIP1组SHIP1的mRNA表达水平和蛋白水平均显著升高(P0.05);细胞存活率显著降低(P0.05);细胞凋亡率显著升高(P0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P0.05)。分别与control组和control+AG490组比较,SHIP1+AG490组的细胞存活率显著降低(P0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P0.05);细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论:SHIP1能够通过抑制STAT3信号通路抑制人白血病细胞生长,促进白血病细胞凋亡。     

钛金属离子介导骨溶解机制中的炎症反应-STAT信号通路

BACKGROUND: Inhibition of osteolysis is an important manner to reduce prosthesis loosening, but the mechanism of osteolysis is still unclear. OBJECTIVE: To analyze the correlation of inflammatory reaction-JAK/STAT signal transduction pathway and titanium metal ion-mediated osteolysis.  METHODS: A total of 50 Kunming mice were divided into five groups. In the sham group, the cranium was injected with physiological saline. In other four groups, the cranium was injected with titanium metal wear particle suspension to establish models of calvarial osteolysis. On day 2 after model establishment, mice in three groups were separately intraperitoneally injected with low-, moderate- and high-dose (1, 10, 100 μmol/L) JAK inhibitor   AG490 10 mL/kg, once a day. 28 days later, osteolysis area, number of osteoclasts, tumor necrosis factor α, vascular endothelial growth factor and interleukin-10 levels, JAK1/2/3 and STAT1/3 protein expression, and Caspase3/9 protein expression were detected in each group. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham surgery group, osteolysis area of mice was significantly larger in the model group (P < 0.01), and the number of osteoclast was significantly more, and inflammatory factor levels were significantly higher (P < 0.01). JAK/STAT signaling pathway protein and apoptotic protein expressions were significantly higher (all P < 0.01). (2) Compared with the model group, osteolysis area was smaller, the number of osteoclasts was less, inflammatory factor levels were significantly less, JAK/STAT signaling pathway protein and apoptotic protein expression was significantly less in the moderate- and high-dose AG490 groups (all P < 0.01). (3) These findings suggested that JAK inhibitor AG490 alleviates titanium metal ion-mediated osteolysis by inhibiting inflammatory reactions and JAK/STAT signaling transduction pathway.      

γ-干扰素通过激活JAK/STAT信号转导途径上调小鼠系膜细胞内HMGB1表达

目的:本实验以小鼠系膜细胞为研究对象,IFN-γ为刺激物,通过检测JAK/STAT信号途经的激活及HMGB1mRNA及蛋白表达,探讨γ干扰素刺激系膜细胞HMGB1表达上调的可能机制。方法:常规培养小鼠系膜细胞(Mousemesangial cell,MMC),无血清培养基同步化后分为正常对照组、IFN-γ(500 U/ml)刺激组和INF-γ+AG490(INF-γ500 U/ml+AG490 200μmol/ml)组。Western blot检测JAK、STAT1和HMGB1蛋白的表达变化,RT-PCR检测HMGB1mRNA的表达变化。结果:Western blot结果显示IFN-γ能够促进小鼠系膜细胞JAK、STAT1磷酸化和STAT1核转位,并呈时间依赖性;AG490能够降低IFN-γ介导的JAK1、JAK2、STAT1的活化,并呈时间依赖性。IFN-γ能够上调系膜细胞中HMGB1mRNA及蛋白表达,并随着刺激时间延长,其相对表达量呈上升趋势,AG490处理后,系膜细胞中HMGB1mRNA蛋白表达降低,并随时间延长而下调。结论:IFN-γ能够促进小鼠系膜细胞HMGB1表达上调,JAK/STAT信号通路激活可能是其主要机制之一。     

血管紧张素(1-7)通过抑制JAK/STAT信号通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

目的:研究血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制JAK/STAT信号通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤。方法:CCK-8检测细胞存活率;Western blot法检测内皮细胞JAK2、STAT3、pJAK2、p-STAT3、cleaved caspase-3和内皮型一氧化氮合酶(e NOS)的蛋白水平;Hoechst 33258染色荧光显微镜照相法检测内皮细胞凋亡数量;DCFH-DA染色荧光显微镜照相法检测内皮细胞内活性氧簇(ROS)的水平。结果:应用高糖(40 mmol/L)处理HUVECs 12~48 h能明显上调JAK2的磷酸化水平,于24 h达最高峰;在24~48 h能明显上调STAT3的磷酸化水平,于36 h最高;在12~24 h能明显上调cleaved caspase-3的表达,在3~48 h随着时间延长,e NOS的表达逐渐降低。2μmol/L的Ang-(1-7)或20μmol/L的JAK/STAT通路抑制剂AG490预处理0.5 h可显著抑制由高糖引起的内皮细胞损伤,表现为p-STAT3、p-JAK2及cleaved caspase-3蛋白水平降低、细胞存活率及e NOS表达升高,细胞凋亡数量和胞内ROS生成减少。结论:Ang-(1-7)能通过抑制JAK/STAT通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。     

Jagged1调控STAT3信号通路影响多发性骨髓瘤细胞的生长和凋亡

目的:研究Jagged1对多发性骨髓瘤细胞生长和凋亡的影响及其机制。方法:多发性骨髓瘤细胞U266转染Jagged1小干扰RNA和小干扰RNA阴性对照,RT-q PCR和Western blot检测细胞中的Jagged1水平,以不做转染的细胞为空白对照,台盼蓝染色,绘制细胞生长曲线,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中信号转导及转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)和Bax的蛋白表达水平。用STAT3信号通路抑制剂AG490处理细胞,检测细胞中p-STAT3水平。AG490处理下调Jagged1表达后的U266细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与空白对照组细胞相比,转染Jagged1小干扰RNA后细胞中Jagged1的mRNA和蛋白水平下降(P0.05),而转染小干扰RNA阴性对照的细胞中Jagged1的mRNA和蛋白水平没有变化。与不做转染的细胞相比,敲减Jagged1表达的U266细胞生长速度降低,细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P0.05)。与不做转染的细胞相比,敲减Jagged1表达的U266细胞中Bax水平升高,p-STAT3水平下降(P0.05)。AG490处理后的U266细胞p-STAT3水平下降,STAT3信号通路激活受阻。AG490可以促进下调Jagged1诱导的U266细胞凋亡,抑制细胞活力。结论:敲减Jagged1表达通过抑制STAT3信号通路促进多发性骨髓瘤细胞凋亡,抑制细胞生长。     

JAK/STAT信号途径参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的：观察Janus激酶/信号转导和转录活化因子(JAK/STAT) 信号的激活对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法:体外培养人肾近曲小管上皮细胞株（HKCs）,分别给予高糖和JAK拮抗剂AG490干预,采用免疫沉淀和Western印迹检测JAK2的磷酸化;Western印迹检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)及信号蛋白STAT1、STAT3、磷酸化STAT1 (phospho-STAT1, p-STAT1) 和p-STAT3的水平; 酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中转化生长因子β₁(TGF-β₁)和I型胶原的分泌,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β₁mRNA表达。结果:与低糖对照组比较,高糖培养的HKCs中α-SMA 的水平及p-JAK2 、p-STAT1 和p-STAT3 比例明显上调；E-cadherin表达明显下调；TGF-β₁ mRNA 表达增加；细胞培养上清液中TGF-β₁、Ⅰ型胶原分泌增加。AG490明显抑制JAK2磷酸化、下调p－STAT1 和p-STAT3的同时,明显抑制高糖刺激HKCs中α-SMA表达的升高，减轻E-cadherin表达下降程度；降低TGF-β₁ mRNA 表达及TGF-β₁、Ⅰ型胶原的分泌。结论:JAK/STAT信号途径参与高糖诱导的HKCs转分化，并刺激TGF-β₁和细胞外基质的分泌。