小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养方法及鉴定技术. 方法 取新生小鼠后肢肌,采用混合酶消化法获得细胞悬液,经Percoll分离,结合差速贴壁法提纯骨骼肌卫星细胞.倒置显微镜观察细胞形态及增殖状况,绘制细胞生长曲线,采用结蛋白、α-肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞. 结果 原代骨骼肌卫星细胞呈圆形,培养1d后逐渐贴壁生长,细胞分布均匀,多呈圆形,48h后开始增殖,此后细胞体积逐渐增大并开始分裂,镜下可见2～3个或多个细胞成串排列,3～4d后细胞进入对数生长期,此时圆形细胞占优势,可见多处局部细胞克隆呈簇样生长.培养7～10d细胞生长至单层且成片分布(50%～70%),梭形或纺锤形细胞增多,但仍有部分细胞呈圆形,12～14d后细胞增殖减缓.免疫细胞化学染色显示,分离得到的小鼠骨骼肌卫星细胞表达肌源性标志物结蛋白联合骨骼肌特异性蛋白α-肌动蛋白. 结论 采用混合酶消化、Pereoll分离结合差速贴壁法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞,结蛋白和骨骼肌肌动蛋白免疫细胞化学染色可更有效地鉴定骨骼肌卫星细胞.     

改良法体外培养大鼠成肌细胞的实验研究

目的:探索一种新型体外分离培养新生大鼠骨骼肌成肌细胞的途径.方法:取新生Wistar大鼠的四肢骨骼肌适量,采用混合酶一步消化分离获取成肌细胞,将差速贴壁法和胰酶消化法相结合进行纯化,观察分离纯化成肌细胞的形态学特点、生长状况,绘制细胞生长曲线,利用扫描电镜观察成肌细胞表面结构并进行结蛋白免疫细胞化学特异性鉴定.结果:采用改良方法分离成肌细胞产量高、耗时短;在培养过程中双重纯化获取的细胞生长状态良好,接种后3～5 d增殖达高峰;在扫描电镜下可观察到成肌细胞膜表面有微绒毛突起;体外培养的成肌细胞中94%的细胞胞质呈结蛋白抗体染色强阳性.结论:改良方法分离纯化大鼠骨骼肌成肌细胞效果理想,是成肌细胞体外培养的有效途径之一.     

骨骼肌内源性生肌因子成肌活性随衰老下降

目的:观察和探讨骨骼肌内源性生肌因子(39kDa)成肌活性随衰老而发生的改变。方法:应用等电聚焦结合聚丙稀酰胺凝胶电泳多步功能测试分筛法对青年和老年大鼠骨骼肌内源性39kDa生肌因子进行分离,利用体外培养和体内模型对青年和老年大鼠骨骼肌生肌因子的成肌活性进行比较,采用增殖细胞抗原(PCNA)免疫组织化学技术观察生肌因子对骨骼肌干细胞—卫星细胞的增殖作用。结果:处理组大鼠骨骼肌内源性39kDa生肌因子C2C12细胞数目显著多于对照组,处理组39kDa生肌因子MTT值显著高于对照组(P <0 . 0 5 )。青年和老年生肌因子处理组都有相当一部分C2C12细胞融合形成肌管,但青年大鼠骨骼肌生肌因子融合形成的肌管数目显著多于老年大鼠。体内研究发现:注射39kDa生肌因子的青年大鼠胫骨前肌中有许多PCNA阳性细胞核,但在对照组中未发现PCNA阳性细胞核。然而,在经注射的老年大鼠胫骨前肌中只发现少量PCNA阳性细胞核。PCNA阳性细胞核半定量计数结果表明:经生肌因子注射的青年大鼠胫骨前肌PCNA阳性细胞核显著多于老年大鼠(P <0 .0 5 )。本研究结果提示:39kDa生肌因子能诱导骨骼肌干细胞—卫星细胞的增殖和分化,青年大鼠骨骼肌中39kDa生肌因子的成肌活性高于老年大鼠,骨骼肌39kDa生肌因子成肌活性随衰老而减弱可能是老年个体     

股中间肌卫星细胞移植对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用

目的:探讨体外培养的股中间肌卫星细胞对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用,为提高对肌肉损伤的治疗提供参考依据。方法:分别取体外培养SD大鼠股中间肌卫星细胞悬液(实验组)与生理盐水(对照组),注入大鼠骨骼肌钝挫伤模型损伤部位,观察比较两组动物损伤修复进程及差异。结果:移植后实验组比对照组恢复效果好。(1)卫星细胞移植后5、10、15天,实验组肌肉组织内荧光标记的肌卫星细胞逐渐减少,形成肌管并最终融合成肌纤维参与损伤修复;(2)移植后5、10、15天大鼠肌电图的纤颤电位和正尖波均逐渐减少,而实验组大鼠异常自发活动的消失较对照组早,且损伤侧肌肉肌电强度振幅和波宽依次增大,逐渐接近正常侧,而对照组肌电强度振幅与波宽则增加缓慢;(3)随着损伤修复的进程,实验组肌肉湿重恢复率逐渐降低并接近1;(4)随着修复的进程,HE染色灰度值逐渐增加,且实验组灰度值大于对照组。结论:股中间肌卫星细胞移植对骨骼肌钝挫伤有明显修复作用。     

肌卫星细胞体外培养及其对胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的反应

目的原代分离、纯化、培养大鼠肌卫星细胞，观察体外培养肌卫星细胞的增殖与分化特性及对类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）刺激的反应。方法选用Wistar大鼠，切取双下肢及背部肌肉，两步酶消化法分离卫星细胞，不连续密度梯度离心法纯化后体外培养，观察其生长与分化特性，绘制生长曲线及融合率曲线，MTT法测定卫星细胞对不同浓度IGF-Ⅰ刺激的反应，并对其生长分数及融合率给予观察。结果此方法可以获得足量、纯度较高的肌卫星细胞。结论适宜浓度（100ng／ml）的IGF-Ⅰ对肌卫星细胞有较强的促增殖及促分化作用。     

外源性机械生长因子对大鼠骨骼肌卫星细胞生物学特性的影响

目的:研究机械生长因子(MGF)促离体培养的骨骼肌卫星细胞增殖的最佳浓度,并观察该浓度对细胞生长曲线、总蛋白及凋亡情况的影响。方法:选用雄性SD大鼠1只,无菌条件下取后肢肌肉,采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,分离及纯化骨骼肌卫星细胞。取第3代骨骼肌卫星细胞,分别采用终浓度为15、25、50、100、200 ng/ml的MGF进行干预,作为实验组;另以单纯加入100μl生长培养基作为对照组,以加入100μl DMEM作为阴性对照组。同步化后,于培养24 h后加入CCK-8溶液。采用CCK-8比色法检测不同浓度MGF下细胞的增殖情况并筛选出最佳浓度后,绘制生长曲线,同时运用BCA法及Hoechst 33342、PI双染法测定最佳增殖浓度的MGF对卫星细胞蛋白合成及细胞凋亡的影响。免疫细胞化学法鉴定骨骼肌卫星细胞。结果:①终浓度为15、25、50、100 ng/ml的MGF均有促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用(P<0.01),其中25 ng/ml MGF促增殖作用最佳。②与对照组相比,MGF组细胞生长曲线左移,倍增时间、平台期均缩短。③与对照组相比,25 ng/ml MGF作用48 h即对骨骼肌卫星细胞有明显的增殖效果(P<0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用骨骼肌卫星细胞48 h和72 h时,其总蛋白含量显著增加(P<0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用72h、96h,骨骼肌卫星细胞的平均凋亡指数显著减小(P<0.05)。结论:①机械生长因子可促进体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞增殖,最佳浓度为25 ng/ml;②25 ng/ml MGF可以使骨骼肌卫星细胞提前进入平台期,缩短生长周期;③25 ng/ml MGF可以抑制骨骼肌卫星细胞的凋亡。     

SIRT1对肌卫星细胞和骨骼肌再生的影响

肌卫星细胞及其子代成肌前体细胞在骨骼肌再生中起关键作用。衰老引起肌卫星细胞数量减少,骨骼肌的再生修复能力受损,肌细胞凋亡速度加快,最终导致肌肉萎缩、肌肉力量下降。SIRT1是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,介导能量代谢调节、细胞增殖分化、氧自由基代谢、基因表达等多种生理过程。SIRT1可通过调节肌卫星细胞的活化、增殖、分化,对骨骼肌的再生能力产生影响。运动训练上调SIRT1的活性和表达水平,促进SC的活化增殖,改善骨骼肌再生。     

肌卫星细胞概述

成熟的骨骼肌纤维细胞是终末分化细胞.骨骼肌对多种生理需求具有很强的适应能力:像生长、训练和损伤等.这个适应过程的发生在很大程度上归功于骨骼肌中的肌卫星细胞.1961年,Mauro A.首先从青蛙骨骼肌纤维中分离出卫星细胞(satellite cell)[1],一般情况,这些细胞位于肌膜(sarcolemma)和基底膜(basal lemina)之间,保持不分裂、静止状态.但是,当肌细胞受到损伤刺激时,卫星细胞即被激活、增生并表达成肌细胞标记物.最终,这些细胞同原有的骨骼肌细胞相互融合,或是彼此融合,形成新的肌纤维细胞[2,3].本文对肌卫星细胞的起源、识别、数量分配、功能等方面的特点作简要综述.     

骨骼肌卫星细胞的生物学特性

196 1年Ｍａｕｒｏ利用电子显微镜从青蛙胫前肌中首次发现卫星细胞 ,根据其形态学特点及其与成熟肌纤维的位置 ,提出卫星细胞可能对机体骨骼肌的正常发育和再生修复有重要意义。正常情况卫星细胞处于相对静止状态 ,但在特定的应激条件下 ,如负重锻炼、创伤等 ,可以被激活进入分裂、增殖期产生成肌前体细胞(ｍｐｃｓ) ,并进一步分化、融合形成肌管参与骨骼肌的修复。目前 ,体外培养的骨骼肌卫星细胞已经被试用于移植修复创伤或萎缩的肌组织 ,本文着重介绍骨骼肌卫星细胞的生物学特性。1　组织学起源和分化潜能　　骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节…     

耐力运动促进骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢及其对成肌分化的影响

目的:观察耐力运动训练对骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢的影响,并探讨其对成肌分化的调控机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为安静对照组(N组)和运动训练组(T组)。12周训练后,两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度。原代培养并体外诱导成肌分化,倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度。分别在分化0 h和24 h测定线粒体呼吸功能、ATP合成活力、膜电位和MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK、p21蛋白表达量。结果 :免疫化学染色显示desmin阳性细胞>90%,表明获取的卫星细胞纯度高。HE染色结果显示T组腓肠肌肌纤维横截面积显著高于N组(P<0.05)。分化0 h时,T组态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)、线粒体ATP合成活力、p21表达较N组显著升高(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。分化24 h时,T组肌管形成数量及MyHC表达较N组显著升高(P<0.05),ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、p21及COXⅣ表达显著增加(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。结论:耐力运动训练可提高未分化卫星细胞线粒体能量代谢水平,继而抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进成肌分化的启动和进程。     

The effect of increased functional load on the activation of satellite cells in the skeletal muscle of adult rats.

The comparison of the number of satellite cells in the fast oxidative glycolytic muscle fibers of m. quadriceps femoris in males of normal Wistar rats aged 16-17 weeks (5 animals) and rats trained for endurance (5 animals) was made. After six weeks of treadmill running at a speed of 35 m/min in an increasing regimen, the number of satellite cells in trained animals (9.59 +/- 1.09%) increased over 2.5-fold in comparison to controls (3.41 +/- 0.26%) within 24 hours. At the ultrastructural level complete and focal injuries of some muscle fibers and the partial denervation of individual muscle fibers were recorded in trained rats. It was proposed that the focal functional denervation of muscle fibers could be one of the factors for the activation of satellite cells in endurance exercise. Some trained rats demonstrated small groups of extra- and perisynaptic satellite cells under the basal membrane of muscle fibres, partial detachment of satellite cells from the surface of muscle fiber and presence in the interstitial space cell containing filaments.     

Myogenic response of human skeletal muscle to 12 weeks of resistance training at light loading intensity

There is strong evidence for enhanced numbers of satellite cells with heavy resistance training. The satellite cell response to very light muscle loading is, however, unknown. We, therefore, designed a 12-week training protocol where volunteers trained one leg with a high load (H) and the other leg with a light load (L). Twelve young healthy men [mean age 25 ± 3 standard deviation (SD) years] volunteered for the study. Muscle biopsies were collected from the m. vastus lateralis of both legs before and after the training period and satellite cells were visualized by CD56 immunohistochemistry. A significant main effect of time was observed (P<0.001) for the number of CD56+ cells per fiber (L: from 0.11 ± 0.02 to 0.13 ± 0.03; H: from 0.12 ± 0.03 to 0.15 ± 0.05, mean ± SD). The finding that 12 weeks of training skeletal muscle even with very light loads can induce an increase in the number of satellite cells reveals a new aspect of myogenic precursor cell activation and suggests that satellite cells may play a role in skeletal muscle adaptation over a broad physiological range.     

The biology of satellite cells and telomeres in human skeletal muscle: effects of aging and physical activity

The decline in the neuromuscular function affects the physical performance and is a threat for independent living in later life. The age-related decrease in muscle satellite cells observed by the age of 70 can be specific to type II fibers in some muscles. Several studies have shown that different forms of exercise induce the expansion of satellite cell pool in human skeletal muscle of young and elderly. Exercise is a powerful non-pharmacological tool inducing the renewal of the satellite cell pool in skeletal muscles. Skeletal muscle is not a stable tissue as satellite cells are constantly recruited during normal daily activities. Satellite cells and the length of telomeres are important in the context of muscle regeneration. It is likely that the regulation of telomeres in vitro cannot fully mimic the behavior of telomeres in human tissues. New insights suggest that telomeres in skeletal muscle are dynamic structures under the influence of their environment. When satellite cells are heavily recruited for regenerative events as in the skeletal muscle of athletes, telomere length has been found to be either dramatically shortened or maintained and even longer than in non-trained individuals. This suggests the existence of mechanisms allowing the control of telomere length in vivo .     

子宫内膜异位症异位内膜细胞原代培养方法的改良

目的：建立一种简易的人异位子宫内膜细胞体外原代培养方法。方法：通过胰蛋白酶消化、贴壁纯化等技术,分离及培养10例子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜细胞。在光学显微镜下观察细胞形态,以免疫细胞化学法鉴定细胞类型。结果：8份标本获得成功,培养的异位内膜细胞均有腺上皮细胞和间质细胞两种形态细胞。膜上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗免疫组化染色为阳性,腺上皮细胞平均生长时间为5周,间质细胞平均生长时间为14周。结论：成功建立了子宫内膜异位症异位内膜细胞体外原代培养方法,该改良培养法经济、简单、高效。     

Enhanced satellite cell proliferation with resistance training in elderly men and women

In addition to the well-documented loss of muscle mass and strength associated with aging, there is evidence for the attenuating effects of aging on the number of satellite cells in human skeletal muscle. The aim of this study was to investigate the response of satellite cells in elderly men and women to 12 weeks of resistance training. Biopsies were collected from the m. vastus lateralis of 13 healthy elderly men and 16 healthy elderly women (mean age 76+/-SD 3 years) before and after the training period. Satellite cells were visualized by immunohistochemical staining of muscle cross-sections with a monoclonal antibody against neural cell adhesion molecule (NCAM) and counterstaining with Mayer's hematoxylin. Compared with the pre-training values, there was a significant increase (P<0.05) in the number of NCAM-positively stained cells per fiber post-training in males (from 0.11+/-0.03 to 0.15+/-0.06; mean+/-SD) and females (from 0.11+/-0.04 to 0.13+/-0.05). These results suggest that 12 weeks of resistance training is effective in enhancing the satellite cell pool in skeletal muscle in the elderly.     

臂丛神经损伤后不同部位肌肉萎缩的检测和机制探讨

目的 研究臂丛神经损伤后不同部位的失神经骨骼肌的萎缩规律，并探讨细胞凋亡和肌卫星细胞的变化在失神经萎缩骨骼肌中发挥的作用。方法 臂丛神经损伤后手术治疗患者50例，术中切取不同部位的失神经骨骼肌80块，按肌肉部位分为A、B两组，A组为小指展肌34块，B组为肱二头肌46块，每块分别进行HE染色、Masson染色、失神经萎缩肌肉中凋亡细胞核的免疫组化染色和透射电镜观察。结果 （1）随时间的延长，肌细胞萎缩愈加明显，A、B组在各时间段比较，差异均无显著性意义。（2）失神经后骨骼肌中染成牟胶原纤维增多，早期增生并不明显，失神经支配1年以上的肌肉中胶原增生更为显著。不同时间组胶原纤维与骨骼肌细胞面积比较，差异有显著性意义（P＜0.05），同一时间段内A、B组比较，差异均无显著性意义。（3）正常的骨骼肌细胞鲜见凋亡细胞核，失神经后骨骼肌随时间延长，其凋亡细胞核的数量增加，而小指展肌中上升速度较肱二头肌快。（4）随着失神经时间的延长，肌卫星细胞含量迅速下降，小指展肌中肌卫星细胞下降速度较肱二头肌快。结论 不同部位的肌肉失神经支配后，萎缩的肌纤维截面积及胶原纤维的增生情况相似，胶原纤维的增生只在晚期才成为影响神经修复手术疗效的原因之一。细胞凋亡与失神经肌萎缩相关，小指展肌中凋亡细胞核数上升较肱二头肌快，提示细胞凋亡导致的肌细胞核数量减少可能是影响神经修复手术疗效的主要原因之一；肌卫得细胞含量的迅速下降可能也是造成其疗效欠佳的另一原因。