鼻咽癌中hMLH1基因启动子甲基化状态及转录表达的研究

目的 探讨鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化状态及其对转录表达的影响.方法 运用甲基化特异性FCR和半定量反转录PCR法检测54例鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化状态及其转录表达水平,分析鼻咽癌组织中hMLH1甲基化与临床资料的关系,以及hMLH1甲基化对转录表达的影响.结果 54例鼻咽癌组织hMLH1基因启动子甲基化频率为42.59%(23/54),鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化与临床资料无关.23例甲基化鼻咽癌组织hMLH1基因相对转录表达水平为0.939 6±0.037 5,31例非甲基化鼻咽癌组织hMLH1基因相对转录表达水平为0.951 3±0.055 1,两者间差异无统计学意义(P>0.05).结论 鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化与临床资料及转录表达水平均无关,表明其转录表达可能不受甲基化调控.     

胰腺癌细胞株中NPTX2基因的甲基化情况研究

目的 探讨神经元正五聚蛋白2(NPTX2)基因在胰腺癌中低表达的分子机制.方法 利用甲基化特异性PCR(MSP)方法 检测2例正常胰腺组织及ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、PANC-1、SW1990 等6株胰腺癌细胞株中NFFX2基因的甲基化情况,并对产物进行测序验证.利用DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-za-dC)处理细胞株ASPC1 及 PANC1,再运用qRT-PCR及SYBR Green荧光掺人甲基化特异性定量PCR法检测NPTX2基凶的mRNA水平及甲基化程度.结果 MSP结果 显示正常胰腺组织中NPTX2基因未发生甲基化,而在6株胰腺癌细胞株中NPTX2基因均有不同程度的甲基化.胰腺癌细胞株ASPC1及PANC-1在5-Aza-dC处理前的甲基化指数(MI)分别为0.964、0.472,mRNA表达的相对值(RQ)分别为5.251和0,而处理后的MI分别为0.531、0.226,RQ分别为5.965和1.076.结论 NPTX2基因启动子的高甲基化是该基因在胰腺癌中表达下降的主要原因之一.     

鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的作用

目的 探讨鼻咽刷洗物检测MSH2和RUNX3基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的作用.方法 选择经病理确诊的鼻咽癌患者54例、慢性鼻咽炎患者18例和健康志愿者20例作为研究对象,运用甲基化特异性PCR检测鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因启动子区甲基化情况,评估将其用于诊断鼻咽癌的特异度和敏感度,分析基因甲基化与鼻咽癌患者临床病理特征的关系.结果 鼻咽癌患者鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化频率分别为70.37％(38/54)和51.85％(28/54),在慢性鼻咽炎患者和健康志愿者中均未检测到MSH2和RUNX3基因启动子甲基化(P＜0.001).鼻咽癌患者鼻咽刷洗物中运用甲基化特异性PCR检测MSH2基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度70.37％; RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度51.85％;平行联合检测MSH2和RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度90.74％.鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因甲基化与患者临床病理特征无显著相关性(P＞0.05).结论 运用甲基化特异性PCR平行联合检测鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化对早期诊断鼻咽癌有高度特异性和敏感度,具有潜在的临床应用价值,但目前尚不能作为判断鼻咽癌临床预后预测指标.     

分化抑制因子1对鼻咽癌细胞增殖的影响及其途径

目的探讨分化抑制因子1(Id1)对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法体外培养人鼻咽癌细胞NP69、CNE1。合成Id1小分子干扰RNA(siRNA),构建Id1表达载体并分别转染鼻咽癌细胞NP69、CNE1。收集Id1siRNA及对照质粒Scramble转染72h的NP69细胞(分别命名为NP69si-Id1、NP69-NC),pcDNA3.1-Id1及对照pcDNA3.1转染48h的CNE1细胞(分别命名为CNE1-Id1、CNE1-Vector),采用RT-PCR及Western blotting检测Id1的表达情况。采用MTT法比较顺铂(DDP)对NP69si-Id1、NP69-NC和CNE1-Id1、CNE1-Vector增殖的影响。采用CalcuSyn软件计算各组细胞对DDP的IC50值。将1μg/ml DDP与鼻咽癌细胞共同孵育24h后,采用Western blo ing检测凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Bad的表达及蛋白激酶B(Akt)Thr308和Ser473的磷酸化情况。结果与NP69-NC比较,NP69si-Id1的Id1 mRNA和蛋白水平明显降低;与CNE1-Vector比较,CNE1-Id1的Id1 mRNA及蛋白水平明显升高。NP69si-Id1细胞对DDP的IC50值(0.207±0.008μg/ml)明显低于NP69-NC(0.405±0.009μg/ml,P<0.05),CNE1-Id1细胞对DDP的IC50值(0.671±0.012μg/ml)明显高于CNE1-Vector(0.445±0.008/ml,P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与NP69-NC比较,NP69si-Id1的Caspase-3断裂带增多,Akt Thr308和Ser473磷酸化减少;与CNE1-Vector比较,CNE1-Id1的Caspase-3断裂带减少,Akt Thr308和Ser473磷酸化增加。结论 Id1可促进鼻咽癌细胞的生长,抵抗DDP诱导的细胞凋亡,其机制可能与增加Akt磷酸化有关。     

5-脱氧氮杂胞苷逆转食管鳞癌细胞系p16基因转录表达研究

目的：探讨5种食管鳞癌细胞株中p16基因转录失活以及去甲基化药物对其作用的机制.方法：采用细胞培养、PCR、DHPLC、MSP、Northern印迹、MTT等方法,检测EC1,EC18,EC109,TE1,TE10食管鳞癌细胞株中p16基因的缺失、突变、甲基化状态和p16的转录表达,观察去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷对p16基因转录表达和细胞增殖能力的影响.结果：除了EC1,其余4种食管鳞癌细胞株均检测出p16基因的不同变化：纯合缺失（EC18）,纯合型甲基化（EC18,EC109）,杂合型甲基化（TE1,TE10）,且纯合缺失的发生率较低（20%）,甲基化的发生率较高（80%）,经过5-Aza-CdR处理,可见2株发生了杂合型甲基化的TE1和TE10细胞p16基因的转录表达得到了逆转.结论：不同食管鳞癌细胞株p16基因转录失活的原因是不同的,启动子区甲基化为主要原因,其中杂合型甲基化可以被去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷逆转,使p16的转录表达上调.     

环氧合酶-2在鼻咽癌的表达及意义

目的:研究环氧合酶2(COX-2)在鼻咽癌中的表达及其意义,探讨COX-2在鼻咽癌的形成,转移中的作用。方法:应用免疫组化法检测正常鼻咽部组织、炎症组织及39例不同临床分期鼻咽癌组织COX-2蛋白的表达,测定转移者与无转移者COX-2的表达。结果:与正常、炎症的鼻咽部组织相比COX-2在鼻咽癌组织过度表达为82%,在鼻咽癌Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为55.6%,80%,100%,在病例TNM分期晚期比早期高(P<0.05),转移者明显高于无转移者(P<0.05)。结论:在鼻咽癌组织中COX-2过度表达,其表达上调与鼻咽癌的形成关系密切,并与肿瘤分期及转移相关,提示COX-2在鼻咽癌的发生、发展中可能起一定作用。     

TIG2基因在肺癌细胞中表达及启动子区甲基化的研究

 目的 探讨TIG2基因在原发性非小细胞肺癌中的表达及意义.方法 应用RT-PCR法检测TIG2基因在肺癌和正常肺细胞中表达变化,用CpG岛预测软件分析TIG2基因启动子和第一外显子区域CpG岛分布,用甲基化特异PCR法(MSP)检测TIG2基因甲基化.用RT-PCR法检测去甲基化试剂作用后TIG2基因的表达.结果 正常肺细胞和癌旁正常组织中TIG2mRNA呈高表达,而肺癌细胞系和组织中低表达或沉默.TIG2基因的启动子和(或)第一外显子区域存在典型的CpG岛.在肺癌细胞系均发生TIG2甲基化,肺癌组织中常发生甲基化,而肺癌旁组织中未见甲基化.去甲基化试剂作用后TIG2基因恢复表达.5-氮-2'-脱氧胞苷浓度越高,TIG2mRNA表达的强度越大.结论 甲基化是导致TIG2基因转录沉默的重要机制,TIG2可能是一种新的肺癌肿瘤抑制基因.     

β-链接素与环氧合酶-2在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的观察β-链接素(β-cat)与环氧合酶-2(COX-2)在鼻咽癌组织中的表达,探讨两者的表达及其联合表达在鼻咽癌发生、发展、侵袭和转移过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学染色法观察50例鼻咽癌石蜡标本和15例正常鼻咽黏膜组织中β-cat、COX-2的蛋白表达情况。结果正常鼻咽黏膜组织中:COX-2未见表达,β-cat胞膜表达,胞质、胞核无表达。鼻咽癌中β-cat胞质有阳性表达,阳性率为72.0%(36/50);COX-2胞质阳性表达率为66.0%(33/50),与正常组比较差异具有统计学意义。鼻咽癌组织中胞质内β-cat、COX-2的表达在不同临床分期及有无淋巴结转移之间差异有统计学意义。在不同年龄及性别之间,差异无统计学意义。两者在胞质的表达强度呈正相关(r=0.584,P=0.000)。结论胞质内β-cat、COX-2的过度表达与鼻咽癌的发生、发展、浸润和转移相关,而β-cat膜表达的降低仅与鼻咽癌的发生有关;胞质内β-cat、COX-2的表达强度呈正相关。     

慢病毒介导的RNA干扰对鼻咽癌细胞株中转移相关基因1的沉默效应

目的 评价鼻咽癌细胞株SUNE1的两个不同转移潜能亚株5-8F和6-10B中转移相关基因1(MTA1)表达的差异,以及慢病毒介导的RNA干扰技术对人鼻咽癌高转移潜能细胞株5-8F中MTA1的沉默效应.方法 采用RT-PCR和Western blotting检测5-8F和6-10B细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达的差异.利用在线数据库和软件设计MTA1 siRNA片段,构建特异性MTA1的慢病毒干扰载体,转染鼻咽癌细胞5-8F,荧光定量PCR和Western blotting检测其MTA1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 5-8F细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达均高于6-10B细胞.经测序分析,插入片段正确;荧光定量PCR 和 Western blotting 检测显示,RNA干扰后MTA1的表达水平明显降低.结论 MTA1可能在促进鼻咽癌细胞株的恶性转化和转移潜能的增强中具有作用.MTA1 siRNA可高效、特异地抑制5-8F细胞MTA1表达,为研究MTA1基因在鼻咽癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具.     

鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性的异质性及其机理探讨

目的　进一步证实人鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在着放射敏感性的异质性 ,并探讨其有关机理。方法　观察人鼻咽癌细胞系CNE 2Z亚克隆株H5和S1的裸鼠移植瘤放射敏感性的不同 ;用流式细胞仪、荧光显微镜、Western blot检测H5和S1凋亡能力的不同及凋亡相关蛋白表达的差异 ;用3H掺入法说明DNA合成抑制率与放射敏感性的不同 ;用RT PCR观察相关癌基因 (fas、p5 3)的表达与放射敏感性的关系。结果　鼻咽癌细胞系CNE 2Z中确实存在放射敏感性的异质性 ,H5、S1两种细胞的凋亡率都随着照射后时间的延长而增加 ,但H5比S1高且差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。两种细胞的DNA合成率于放射前无差别 ;照射后都较放射前受到抑制 (P <0 0 5 ) ,H5受抑制程度大 (P <0 0 5 )。H5与S1细胞fas、p5 3基因的表达差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　本实验再次证实了鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在放射敏感性异质性 ,并证实了其异质性的机理与细胞受射线照射后引起凋亡的能力不同有关、与DNA合成的抑制率成正相关、与癌基因fas、p5 3的表达无关。     

5-ALA-PDT对两种鼻咽癌细胞EBV-C666-1和CNE2的杀伤效应研究

目的比较处于不同细胞生长期的EBV-C666-1和CNE2鼻咽癌细胞加入相同浓度5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid,5-ALA)孵育相同时间后,所产生PpⅨ总量的差异以及对PDT的响应情况。方法通过计数法测定C666-1和CNE2细胞的生长曲线,利用荧光光谱技术检测处于不同生长期的细胞吸收5-ALA所生成的PpⅨ含量,应用激光共聚焦显微技术观察5-ALA-PpⅨ在两种细胞中的亚细胞分布。分别在细胞培养24,48和72 h后,对两株细胞进行光动力(photodynamic therapy,PDT)实验,使用CCK-8(cell counting Kit-8)比色法测定细胞存活率。结果 C666-1细胞中5-ALA-PpⅨ的含量明显低于CNE2细胞。同种细胞在不同生长期吸收5-ALA后所生成的PpⅨ的含量也存在显著差异。5-ALA-PpⅨ主要分布在C666-1细胞的线粒体,而在CNE2细胞中主要分布于细胞膜。相同实验条件下,C666-1细胞在培养24和48 h的PDT实验中,存活率低于CNE2,而在细胞培养72 h后的PDT实验中,存活率高于CNE2。结论处于不同生长期的C666-1和CNE2细胞吸收5-ALA后所生成的PpⅨ的含量存在显著差异,细胞中PpⅨ的含量和分布是影响PDT疗效的重要因素。     

P-gp糖蛋白及其编码的基因在受照射鼻 咽癌细胞株中的表达

目的模拟临床放射方法对人鼻咽鳞癌CNE细胞分次照射，检测照射前、后CNE细胞肿瘤多药耐药蛋白P-gp及其编码的基因MDR1的表达和功能。方法对人鼻咽鳞癌CNE细胞进行体外培养，待细胞进入指数生长期后模拟临床放疗方法进行X射线分割照射，2Gy／（d·f^-1），连续5d，总剂量10Gy。于照射前、照射后4、8、13、17和21d分别收取标本进行检测。利用RT-PCR、免疫细胞化学检测照射前、后人鼻咽鳞癌CNE细胞MDR1及P-gp的表达；MTT法检测其耐药指数（RI）的变化，评价P-gp的功能。结果人鼻咽鳞癌CNE细胞MDR1基因照射前呈弱表达，照后4d过度表达，8d到21d表达逐渐降低，与照射前比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；其编码的蛋白产物P-gp照射前、照射后4和8d呈弱表达，13至21d表达增高，P-gp迟于MDR1基因高表达。MTT法检测耐药指数结果显示：照射前、照射后4和8d RI值均为1，13、17和21d RI分别增高为8、10和11．2，RI值变化的情况与P-gp的变化情况相一致。结论人鼻咽鳞癌CNE细胞照射前MDR1及P-gp呈弱表达，有原始的低度耐药性；照射后MDR1及功能性P-gp高表达并且持续一段时间。     

5-氨基乙酰丙酸光动力杀伤人鼻咽癌细胞株的实验研究

目的 探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)光动力学效应(PDT)杀伤人鼻咽癌细胞株CNE2的可能性.方法 对培养的CNE2分别加入不同浓度的5-ALA(0.01、0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L)孵育4h,予波长630nm的半导体激光照射,照射能量密度分别为20、10、5、2J/cm2,继续孵育6、12、24h,用四唑盐比色法分别测定细胞存活率.结果 5-ALA-PDT能有效杀伤人鼻咽癌CNE2细胞,其杀伤程度与照射后孵育时间、5-ALA浓度和激光剂量呈正相关(P＜0.01).激光照射后12h,激光能量为20J/cm2,5-ALA浓度为0.5mmol/L时,其杀伤作用最明显.结论 体外培养CNE2细胞对5-ALA介导的PDT敏感.     

鼻咽癌CT影像与增殖细胞核抗原表达的相关性研究

目的：探讨鼻咽癌（NPC）CT影像和增殖细胞核抗原（PCNA）的关系，深入认识CT征象的意义。资料与方法：搜集放疗前进行过CT检查的NPC活检标本69例（其中3年随访36例），采用免疫组织化学S－P法检测PCNA表达情况，详细分析NPC的CT表现为PCNA表达的关系。结果：（1）69例中，PCNA阳性率为94．3％（65／69），茎内软组织增厚致密PCNA高表达率（＞50％）为68．4％（26／38），而茎内软组织正常PCNA高表达率40．7％（11／27），两者有显著性差异（P＝0．026）；（2）当肿瘤累及后鼻孔鼻腔时，其PCNA高表达率较未受累者高（P＝0．04）；（3）当茎内软组织增厚致密时，其放疗后3年无瘤生存率低于茎内软组织正常者（P＝0．005）。结论：放疗前茎内软组织增厚致密者，PCNA多呈高表达，放疗后更易发生复发。     

青蒿素对人鼻咽癌CNE细胞的放射增敏作用及机制的研究

目的 探讨青蒿素对人鼻咽癌CNE细胞的放射增敏作用。方法 应用甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测青蒿素对鼻咽癌CNE细胞的抑制效应;克隆形成实验观察青蒿素对CNE细胞的放射敏感性的影响;流式细胞术测定照射后CNE细胞周期的再分布。结果 青蒿素对CNE细胞的抑制率呈药物剂量依赖性增加。青蒿素能明显增加γ射线对CNE细胞的克隆形成抑制作用,1 μmol/L青蒿素对CNE细胞的放射增敏比(SER)为1.26。青蒿素能够去除γ射线照射后CNE细胞的G₂/M期阻滞,与单纯6 Gy照射组相比,青蒿素+照射组G₂/M期阻滞减少。结论 青蒿素通过减弱辐射诱导的G₂/M期阻滞,从而增加γ射线对CNE细胞的杀伤作用。     

高压氧对鼻咽癌细胞生长与氧自由基的影响

目的 通过观察高压氧处理后人鼻咽癌细胞系CNE-2细胞生长抑制率和死亡率及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的变化,初步探讨高压氧处理对鼻咽癌细胞生长的影响及其机制.方法 将实验培养的人鼻咽痛CNE-2细胞分为A组(对照组)、B组(高压氧0.15 MPa)、C组(高压氧0.20 MPa)、D组(高压氧0.25 MPa)和E组(高压氧0.30 MPa).采用MTT法分析细胞生长抑制率,PI染色观察细胞死亡情况,并采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的含量、硫代巴比妥法测定MDA的含量.结果 高压氧处理各组的细胞死亡率、MDA含量均较A组明显增加,比较差异均有统计学意义(P<0.05);各组鼻咽癌CNE-2细胞生长抑制率、死亡率和MDA含量比较差异有统计学意义(P<0.05),且均随高压氧处理压力升高而增加.结论 高压氧处理增加实验培养的人鼻咽癌CNE-2细胞生长抑制率、死亡率,可能与高压氧处理增加鼻咽癌CNE-2细胞内氧自由基有关.     

原发鼻咽淋巴瘤与鼻咽癌的18F-FDG PET/CT诊断与鉴别

目的探讨18F-FDG PET/CT在鉴别诊断原发鼻咽淋巴瘤（PNL）与鼻咽癌（NPC）中的价值。 方法回顾性分析经病理证实、检查前未经过肿瘤治疗的33例PNL和71例NPC患者的PET/CT资料,对鼻咽部病变形态、范围、周围浸润、体积、SUV_max及淋巴结浸润或转移情况进行对比分析,另单独选取PNL中的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）与NPC患者的鼻咽肿块体积、SUV_max进行比较。应用SPSS13.0软件进行独立样本t检验及四格表χ2检验。 结果33例PNL患者中20例病变呈弥漫性浸润鼻咽全壁（双侧对称14例、双侧不对称6例）,未完全浸润全壁13例（单侧7例、双侧6例）;71例NPC患者中10例呈弥漫性浸润鼻咽全壁（双侧对称4例、双侧不对称6例）,未完全浸润全壁61例（单侧39例、双侧22例）;PNL、NPC组累及全壁与不全、单侧与双侧、对称与不对称间差异均有统计学意义（χ2=23.75、10.38、16.74,均P < 0.001）。PNL、NPC病变患者局限于鼻咽壁者分别有26、17例,累及深部结构者分别有7、54例,两者间差异有统计学意义（χ2=27.94,P < 0.001）。PNL、NPC患者中,病变凸入鼻后孔的分别有21、24例,两者之间的差异有统计学意义（χ2=8.17,P < 0.05）。PNL、DLBCL和NPC患者鼻咽肿块体积分别为（3.70±5.53）×104、（5.05±6.89）×104、（2.06±2.31）×104 mm3,PNL、DLBCL患者与NPC患者鼻咽肿块体积之间的差异均无统计学意义（t=1.63、1.85,均P>0.05）。PNL、DLBCL、NPC患者肿块SUV_max分别为12.00±6.34、14.26±6.42、10.09±4.41,PNL患者与NPC患者间差异无统计学意义（t=1.55,P>0.05）,DLBCL患者与NPC患者间差异有统计学意义（t=2.67,P < 0.05）。PNL患者中26例伴有咽旁或颈部淋巴结浸润,NPC患者中51例伴有咽旁或颈部淋巴结转移,淋巴结SUV_max、最大者长径、短径及平均直径间差异均无统计学意义（t=0.79、1.37、2.03、1.71,均P>0.05）。26例伴有咽旁或颈部淋巴结浸润的PNL患者中3例可见轻度坏死,51例伴有咽旁或颈部淋巴结转移的NPC患者中31例可见坏死,两者差异有统计学意义（χ2=16.94,P < 0.001）。26例伴有咽旁或颈部淋巴结浸润的PNL患者中淋巴结融合5例,51例伴有咽旁或颈部淋巴结转移的NPC患者中淋巴结融合6例,两者间的差异无统计学意义（χ2=0.78,P>0.05）。 结论18F-FDG PET/CT在PNL及NPC鉴别诊断中具有一定价值。PET/CT主要通过病变形态、范围、深部结构浸润、淋巴结坏死等方面进行鉴别;不同病理亚型淋巴瘤可高于或低于NPC代谢,DLBCL代谢活性高于NPC;病变体积不能作为主要的鉴别诊断依据。