甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/smad信号通路的影响

目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/smad信号通路的影响.方法 收集瘢痕疙瘩及正常皮肤组织各15例,免疫组化检测磷酸化smad2(p-smad2)和磷酸化smad3(p-smad3)在瘢痕疙瘩和正常皮肤中的阳性表达率;将瘢痕疙瘩分为实验组和对照组,实验组以5-氮杂-2-脱氧胞苷(5×10-5mmol/L)干预,对照组用等量的DMEM培养液,采用组织块法培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,流式细胞仪分析5-氮杂-2-脱氧胞苷(5×10-5mol/L)对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期及凋亡的影响;Western blot检测各组p-smad2、p-smad3、TGF-β1和smad7的表达变化;细胞免疫荧光染色法观察各组瘢痕疙瘩成纤维细胞内p-smad2和p-smad3蛋白的影响.结果 瘢痕疙瘩组织中p-smad2和p-smad3阳性表达率明显高于正常皮肤组织中p-smad2和p-smad3阳性表达.流式细胞仪显示5-氮杂-2-脱氧胞苷干预瘢痕疙瘩成纤维细胞后,细胞停滞于G0/G1期比例增加并且细胞凋亡率增加,瘢痕疙瘩成纤维细胞中p-smad2和p-smad3蛋白的表达减少,同时,TGF-β1蛋白表达减少,smad7蛋白表达回升.此外,5-氮杂-2-脱氧胞苷抑制smad2和smad3磷酸化及核转移.结论 甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及促进其凋亡,其作用机制可能与抑制TGF-β/smad信号通路有关.     

TGF-β1和TNF-α协同刺激诱导人支气管上皮细胞优化上皮间质转化模型

目的探索转化细胞生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)协同刺激诱导人气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,HBE)细胞,优化上皮间质转化细胞模型的效果。方法采用空白对照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml刺激诱导HBE细胞24 h后,观察细胞的变化。采用CCK8、细胞迁徙、蛋白印迹实验来实现。结果 TGF-β1+TNF-α协同诱导下大多数细胞从鹅卵石样形态变化为梭形、边界消失、间隙明显增宽。空白对照组、TGF-β1 10 ng/ml组、TNF-α10 ng/ml组、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml组的细胞迁移距离分别为(420.06±10.38)μm、(499.86±34.00)μm、(514.93±10.56)μm和(569.68±33.58)μm。TGF-β1+TNF-α组与对照组、TGF-β1、TNF-α的差异有统计学意义(P0.05)。TGF-β1+TNF-α协同诱导时,上皮标志物E-cadherin明显降低,间质标志物Vimentin明显升高。结论在HBE细胞中采用TGF-β1和TNF-α协同诱导可以优化细胞上皮间质转化模型。     

钩藤碱通过Nrf2/HO-1信号通路抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎症等损伤的影响及其分子机制。方法 将大鼠软骨细胞分为对照组、IL-1β(10 ng/mL)组、IL-1β+钩藤碱(5、25、50μmol/L)组;MTT实验检测钩藤碱对细胞活性的影响;Western blot方法检测Bcl2、Bax、MMP3、MMP13、CollagenⅡ、Nrf2和HO-1蛋白水平;ELISA方法检测炎性因子PGE2、COX-1、TNF-α和ROS水平;试剂盒检测MDA水平。结果 与对照组相比,IL-1β组细胞活性明显抑制(P<0.05);与IL-1β组相比,钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组细胞活性增强(P<0.05)。与对照组相比,IL-1β组Bcl2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加(P<0.05);与IL-1β组相比,钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组Bcl2蛋白表达增加,钩藤碱50μmol/L组Bax蛋白表达减少(P<0.05)。与对照组相比,IL-1β组MMP13和MMP3蛋白表达上调,CollagenⅡ蛋白表达下调(P<0.05);与IL-1β组...     

止消通脉宁干预TGF-β1诱导的HK-2细胞VEGF mRNA的表达

目的:通过观察止消通脉宁药物血清干预转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达,进一步探讨其在防治肾间质纤维化方面的作用。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110ng/ml)、空白血清对照组(TGF-β110ng/ml+10%空白血清)、干预1组(TGF-β110ng/ml+10%低剂量止消通脉宁药物血清)、干预2组(TGF-β110ng/ml+10%中剂量止消通脉宁药物血清)、干预3组(TGF-β110ng/ml+10%高剂量止消通脉宁药物血清)。药物干预24h后,荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,VEGF mRNA的表达显著上升,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),经止消通脉宁药物血清干预后,VEGFmRNA的表达逐步下降,与单纯TGF-β1诱导组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:止消通脉宁在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化,其机制的可能与调节纤维化细胞因子VEGF的mRNA表达有关。     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制

目的 探究LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads信号轴对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)成骨分化中的影响。方法 通过构建慢病毒载体及慢病毒包装,将含有目的基因的慢病毒感染细胞。将hBMSC分为Control组、NC组、MEG3、sh-MEG3、MEG3+miR-133a-3p sponge及MEG3+miR-133a-3p组,成骨诱导后,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色和茜素红染色检测ALP活性及钙盐沉积,qRT-PCR检测各组细胞中MEG3、miR-133a-3p、TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN mRNA表达水平,Western blot检测TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN蛋白表达量。结果 与NC组比较,MEG3组的ALP活性及茜素红钙盐沉积明显减弱,MEG3 mRNA上调,miR-133a-3p mRNA表达显著升高,TG...     

细胞因子对关节软骨细胞增殖的实验研究

目的探讨细胞因子对关节软骨细胞增殖的影响。方法应用关节软骨细胞体外培养，分别加入IL-1β，TNF-α，TGF-β1，IL-1β和TGF-β1，TNF-β和TGF-β1，采用MTT法观察软骨细胞增殖情况，瑞氏染色观察细胞形态及分裂指数测定。结果细胞因子作用软骨细胞24h，与对照组比较，1ng／ml、10ng／ml TGF-1组，10ng／ml IL-1β和1ng／ml TGF-β1组，高于对照组。细胞因子作用软骨细胞48h，与对照组比较，20ng／ml IL-1β组，1ng／ml、10ng／ml TNF-α组，0．1、1、10ng／ml TGF-β1，10ng／ml IL-1β和1ng／ml TGF-β1组，1ng／ml TNF-α和1ng／ml TGF-β1组，高于对照组。IL-1β，TNF-α作用软骨细胞24h，形态发生改变。培养48h，分裂指数测定10ng／ml TGF-β1组显著高于对照组。结论TGF-岛对体外培养关节软骨细胞有明显促进细胞分裂与增殖作用，IL-1β，TNF-α，作用软骨细胞48h也有促进细胞增殖作用。     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂拮抗人皮肤成纤维细胞转化生长因子β1机制研究

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂拈抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的效应机制.方法 体外培养正常成人皮肤Fb,根据培养基中所加刺激物不同分为空白对照组(无血清DMEM培养基),TGF-β1组(DMEM培养基加入含终浓度10 ng/mL TGF-β1作用48 h),曲格列酮组(DMEM培养基加入含终浓度10μmol/L曲格列酮作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48h),15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)组(DMEM培养基加入含终浓度10 μmol/L 15d-PGJ2作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48 h).应用蛋白质印迹法检测结缔组织生长因子(CTGF)的表达,实时荧光RT-PCR检测CTGF、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平变化.对数据进行单因素方差分析.结果 TGF-β1组的CTGF蛋白和mRNA表达水平均高于空白对照组,曲格列酮组和15d-PGJ2组的CTGF蛋白及mRNA表达水平低于TGF-β1组.空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ 2组MMP-1 mRNA表达水平分别为1.281±0.195、0.193±0.051、0.417±0.043、0.485±0.027,其中TGF-β1组低于空白对照组(F=12.811,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组高于TGF-β1组(F=12.811,P值均小于0.01).空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ2组PDGF mRNA表达水平分别为0.349±0.057、1.044±0.237、0.677±0.055、0.511±0.017,其中TGF-β1组高于空白对照组(F=16.848,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组低于TGF-β1组(F=16.848,P值均小于0.01).结论 激活后的PPARγ对TGF-β1下游反应因子CTGF的抑制作用,可能是其拮抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的主要机制,而对细胞因子MMP-1、PDGF的影响可能也是其机制之一.     

前列腺素E1通过TGF-β_1-Smad2/3-ILK信号通路对足细胞上皮间质转分化的影响

目的:研究前列腺素E1(Prostaglandin E1,PGE1)通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路对足细胞上皮间质转分化的影响。方法:体外培养和分化小鼠肾小球足细胞,按培养条件不同分为,正常对照组(含5.6 mmol/L葡萄糖),高渗组(含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇),高糖1组(含15 mmol/L葡萄糖),高糖2组(含30 mmol/L葡萄糖)。每个培养条件分别以0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml的PGE1进行干预,干预24 h后收集足细胞。用Western-blot检测TGF-β1、P-Smad2/3、ILK、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)的表达情况。结果:(1)足细胞TGF-β1、P-Smad2/3、ILK、α-SMA蛋白表达相对量较正常对照组上调,高糖1、2组均与正常对照组差异显著(P0.05)。(2)各组PGE1=1 ng/ml、PGE1=10 ng/ml足细胞TGF-β1、P-Smad2/3、ILK、α-SMA蛋白表达相对量分别较各组中PGE1=0时显著升高(P0.05)。高糖1、2组PGE1=20 ng/ml足细胞TGF-β1、P-Smad2/3、ILK、α-SMA蛋白表达相对量分别较各组中PGE1=0时显著降低(P0.05)。结论:PGE1对转分化信号通路TGF-β1-Smad2/3-ILK有调节作用,对高糖引起的足细胞转分化有抑制作用。     

苦参碱调控Snail2表达水平抑制转化生长因子β1诱导的人腹膜间皮细胞上皮间充质转分化

目的 研究苦参碱对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导腹膜间皮细胞上皮间充质转分化(EMT)后转录因子Snail2的影响.方法 采用TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞并同时予不同浓度苦参碱干预处理,实验分为空白对照组、TGF-β1(5 ng/ml)诱导组、TGF-β1+0.4 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.6 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.8 mg/ml苦参碱干预组和TGF-β1+1.0 mg/ml苦参碱干预组.实时荧光定量PCR和Western印迹检测Snail2、上皮标志分子E钙黏蛋白(E-cadherin)和间质标志分子α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原Ⅲ(ColⅢ)的表达,Western印迹检测Smad2、Smad3和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白磷酸化水平.结果 TGF-β1(5 ng/ml)刺激能上调人腹膜间皮细胞Snail2、α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平,上调Smad2、Smad3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,下调E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平;苦参碱(0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml)干预处理后能下调Snail2和α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平以及ERK1/2的蛋白磷酸化水平,上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平.结论 TGF-β1能诱导人腹膜间皮细胞EMT,苦参碱可能通过ERK1/2信号通路下调Snail2的表达水平来抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT.     

抑肽酶对肿瘤坏死因子-α活化人脐静脉内皮细胞的作用

目的探讨抑肽酶对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化人脐静脉内皮细胞的作用。方法采用Ficoll液提取高纯度的健康成人中性粒细胞(PMN)。体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为3 组,对照组(C组):给予等量培养液;TNF-α活化组(T组):给予TNF-α 2 ng/ml,作用时间5 h;抑肽酶 TNF-α组(A T组):给予抑肽酶250 KIU／ml,作用时间6 h,1 h后给予TNF-α2 ng/ml,作用时间5 h。用细胞培养小室测定PMN跨迁单层融合的人脐静脉内皮细胞的迁移率,采用免疫细胞化学法测定人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)以及细胞连接蛋白β-链蛋白的表达。结果与C组比较, T A T组ICAM-1表达和PMN迁移率增加,β-链蛋白表达下降(P<0．05);与T组比较,A T组 ICAM-1表达和PMN迁移率降低,β-链蛋白表达增多(P<0．05)。结论抑肽酶可抑制TNF-α对人脐静脉内皮细胞的活化。     

TGF-β1和TGF-α在膀胱癌侵袭和转移中的作用

目的 探讨转化生长因子-β（TGF-β1）和转化生长因子－α（TGF-α）对膀胱癌细胞株（EJ）生长的影响以及促进膀胱癌侵袭和转移的可能途径。方法 采用MTT、Western Blot和RT－PCR方法,观察TGF－β1和TGF－α对DJ细胞株生长以及在mRNA和蛋白水平上对金属基质蛋白酶（MMPs)和组织特异性金属蛋白酶抑制剂－2（TIMP－2）表达的影响。结果 （1）TGF-β1和TGF－α对EJ细胞生长存在抑制趋势,但差别无显著性意义。（2）TGF－β1和TGF－α作用于EJ细胞48h时 ,MMP－2、TIMP－2、MT1－MMP mRNA表达降低;TGF－β1组MMP-9 mRNA表达增加,而对照组和TGF－α组无MP－9mRNA表达。（3）当TGF－β1浓度为0．1、1．0ng/ml时,增加细胞培养上清液中MMP－2蛋白含量对TIMP－2蛋白水平无影响。当浓度为5．0、10．0ng/ml时对MMP－2无影响而降低TIMP－2表达;TGF－α在浓度为1.0、5.0、10.0ng/ml时,对MMP－2蛋白表达无影响而降低TIMP－2表达;在100．0ng/ml时增加MMP－2蛋白表达而对TIMP－2表达无影响;无论在对照组和实验组均未检测到MMP－9。结论 TGF-β1、TGF-α不能抑制EJ细胞生长,参与肿瘤侵袭和转移作用可能与调节MMPs、TIMP－2表达途径有关。     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

孤儿核受体Nur77在衣霉素诱导小鼠海马神经元损伤中的作用：与内质网应激的关系

目的评价孤儿核受体Nur77在衣霉素(TM)诱导小鼠海马神经元损伤中的作用及其与内质网应激的关系。方法小鼠HT22细胞, 采用随机数字表法分为4组(n=10):对照组(C组)、Nur77特异性激动剂Csn-B组(Csn-B组)、内质网应激诱导剂TM组(TM组)和TM+Csn-B组。C组细胞正常培养24 h;Csn-B组培养基中加入Csn-B(终浓度为10 μg/ml)培养细胞24 h;TM组培养基中加入TM(终浓度为200 ng/ml)培养24 h诱导细胞内质网应激损伤;TM+Csn-B组培养基中加入Csn-B(终浓度为10 μg/ml)预处理细胞15 min后, 给予TM(终浓度为200 ng/ml)共同培养24 h。各组细胞处理结束后采用CCK-8试剂盒检测细胞活力, Western blot法检测内质网应激相关蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和活化的caspase-3(cleaved-caspase-3)的表达。结果与C组比较, TM组细胞活力下降, CHOP、GRP78、Ba...     

褐藻多糖硫酸酯对转化生长因子-β_1孵育下人肾小球系膜细胞FN分泌的影响

目的:观察褐藻多糖硫酸酯(fucoidan,FPS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)刺激下人肾小球系膜细胞(human mesangial cell,HMC)纤连蛋白(fibronectin,FN)分泌的影响,探讨其在慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)防治中的意义。方法:体外培养HMC并鉴定,不同浓度的FPS分别孵育TGF-β_1作用下HMC 24 h、48 h、72 h,具体分组如下:模型组(TGF-β_14 ng/ml)、FPS高剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 100μg/ml)、FPS中剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 50μg/ml)、FPS低剂量组(TGF-β_14 ng/ml+FPS 25μg/ml)、正常对照组。Western-blot技术检测HMC FN蛋白表达,Real-time PCR技术检测HMC FN mRNA表达。结果:与正常对照组相比,TGF-β_1能明显诱导人肾小球系膜细胞FN蛋白及mRNA表达(P0.01);与模型组相比,FPS对TGF-β_1引起的HMG FN蛋白及mRNA高表达有明显拮抗作用,并与剂量有关(P0.05)。结论:FPS能拮抗TGF-β_1诱导的HMG FN蛋白及mRNA表达增加,减少病理状态下细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)的产生,这可能是其防治CRF的作用机制。     

温阳消癥方调控LncRNA MEG3对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子的影响

目的:探讨温阳消癥方对TGF-β₁诱导的人近端肾小管上皮细胞LncRNA MEG3的调控作用及对纤维化因子的影响。方法:体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分为对照组、TGF-β₁组、TGF-β₁+3.5 mg/ml温阳消癥组、TGF-β₁+14 mg/ml温阳消癥组，MTT法检测细胞增殖，实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)表达，蛋白质印迹法检测α-SMA、FN、CTGF蛋白表达。结果:3.5、7、14 mg/ml温阳消癥不影响细胞增殖，35 mg/ml组细胞增殖明显降低(P<0.01);与对照组比较，TGF-β₁组中α-SMA、FN、CTGF mRNA、LncRNA MEG3及FN、CTGF蛋白表达显著升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达升高(P<0.05);与TGF-β₁     

TNF-α、TGF-β_1在慢性非细菌性前列腺炎患者前列腺液中的表达及意义

目的探讨TNF-α和TGF-β1在慢性非细菌性前列腺炎患者前列腺液中的表达及临床意义。方法采用双抗体夹心法对20例炎症型慢性非细菌性前列腺炎即炎症型慢性骨盆疼痛综合征(Ⅲa型),20例非炎症型慢性非细菌性前列腺炎即非炎症型慢性骨盆疼痛综合征(Ⅲb型),10例健康对照者前列腺液(EPS)中TNF-α、TGF-β1含量进行测定。采用美国国立卫生院慢性前列腺炎症状评分(NIH-CPSI)进行相关性研究。结果①TNF-α在Ⅲa型患者EPS中表达水平[(152.44±83.06)pg/ml]明显高于Ⅲb型组[(93.15±57.26)pg/ml]和健康对照组[(78.99±53.51)pg/ml],P<0.05。但在Ⅲb型和健康对照组之间差异无统计学意义,P>0.05。②TGF-β1在Ⅲa型组[(8477.50±4612.45)pg/ml]和Ⅲb型组[(7946.50±5044.06)pg/ml]表达水平均明显高于健康对照组[(2462.50±985.31)pg/ml],P<0.01。但在Ⅲa和Ⅲb型之间差异无统计学意义,P>0.05。③前列腺液中TNF-α、TGF-β1的水平与慢性前列腺炎症状评分无相关性(r=0.23,P>0.05;r=0.31,P>0.05)。结论前列腺液中细胞因子(TNF-α、TGF-β1)在慢性前列腺炎的病理学改变中起重要作用,可作为慢性前列腺炎的诊断依据之一。     

A20介导TNF-α炎症微环境下髓核细胞衰老的机制研究

目的 :探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制。方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞。实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代)。应用CCK-8细胞增殖实验﹑β半乳糖苷酶染色﹑Western blot(WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化。应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20﹑NF-κB(p65)﹑NF-k B(p-p65/phospho S536)表达情况。结果 :与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高。WB检测显示:TNF-α可以诱导p53﹑A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20﹑p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加。结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κB信号通路。而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低。