旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的　克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法　根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果　RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论　应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;结果还提示在旋毛虫河南株之间可能存在有遗传多态性     

2株间日疟原虫18SrDNA的克隆及其同源性分析

目的克隆间日疟原虫河南分离株与湖北分离株红内期18SrDNA,并进行同源性分析。方法采用PCR方法从间日疟患者血样DNA中扩增间日疟原虫18SrDNA,纯化后与pGEM．Teasy质粒连接,转化大肠埃希氏菌JMl09;阳性克隆质粒经双酶切鉴定后,进行序列测定,采用BLAST和MEGA4生物软件分析同源性。结果间日疟原虫18SrDNA扩增片段大小为998bp：阳性克隆重组质粒经双酶切鉴定,与预期结果相符;序列测定结果显示,河南、湖北2分离株间日疟原虫18SrDNA序列完全相同．与GenBank中报道的12株间日疟原虫相同序列进行比对,其同源性均大于99％：用邻位连接法（neigh—bor-joining,NJ）和非加权组平均法（UPGMA）2种方法构建系统发生树发现,河南分离株、湖北分离株与间日疟原虫X13926．1株遗传距离小．同属一个分支。结论克隆了间日疟原虫河南与湖北分离株红内期18SrDNA,该基因序列在不同地理株间遗传稳定。     

旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析

目的克隆一个新的旋毛虫基因即亲肌肉抗原(myophilin)并分析其序列同源性,为旋毛虫病疫苗的研制奠定基础。方法检索GenBank旋毛虫基因组数据库,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物(上、下游引物分别含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点)。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体pMD-19T分别用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3︰1的比例与pMD-19T连接,然后转化到DH5a大肠埃希菌感受态细胞中,用Amp抗性培养基培养,阳性克隆提质粒后做PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。结果 RT-PCR扩增出旋毛虫亲肌肉抗原全长基因序列,大小为579bp;亲肌肉抗原基因重组质粒经双酶切得到的片段大小分别为579、2 300和300bp,与预期值相符;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%。结论成功克隆出旋毛虫亲肌肉抗原基因,为旋毛虫病疫苗的研制奠定了基础。     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建

目的　构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒。 方法　本文采用PCR方法扩增出LMO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin ,hly)基因 ,将其克隆到pMD18-T中 ,筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒 ,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定。结果　hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6bp。核苷酸序列鉴定后 ,其核苷酸序列与国外报道的LMOF6 789株、LMOF2 36 5株同源性分别为 99 70 %和 99 39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99 82 %和 98 90 %。重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子。结论　在国内首次克隆到LMOhly全基因 ,并构建出含hly基因的原核表达载体。此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础。     

广西两地旋毛虫分离株5S rDNA序列分析

目的 应用5S rDNA序列分析，鉴定广西德保、南丹两地旋毛虫分离株。 方法 PCR扩增2个分离株5S rDNA片段，并对扩增产物进行测序；用相关软件分析序列的同源性、遗传距离，同时构建系统发生树，并与GenBank中旋毛虫相应基因序列进行比较。 结果 广西德保、南丹2地旋毛虫分离株和GenBank中Trichinella spiralis的5S rDNA碱基序列长度相同，为695 bp；变异位点4个，与T. spiralis的相似度分别为99.0%和99.1%，与GenBank中其他相应基因的相似度低于94.2%，2个分离株之间的相似度为98.8%。2个分离株之间及与T. spiralis间的遗传距离最小，均为0.014；而与其他旋毛虫的遗传距离均大于0.056；用邻接法（N-J法）和最大简约法（MP法）构建的2个系统发生树中，2个分离株与T.spiralis位于同一分支，自引导值分别为96及99。 结论 初步鉴定广西德保和南丹旋毛虫分离株均为T.spiralis。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)基因序列，比较FCC1／HN株与国外分离株FEN-1基因序列的差异。方法 根据FEN-1基因已知序列设计合成1对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出FEN-1基因，构建重组质粒PMD18-T-FEN-1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN-1基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株FEN-1基因序列，基因全长1947bp，A T含量为56％，G C含量为44％。酶切鉴定获得了正确的PMD18-T-FEN-1重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN-1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株FEN-1基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外已报道各株的FEN-1基因序列有高度同源性。     

应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定

目的对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定。方法根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochromec-oxidase subunitⅠ,COXⅠ）基因序列合成1对引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T.nativa,T2）、布氏旋毛虫（T.britovi,T3）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、纳氏旋毛虫（T.nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP）技术对我国7个猪源旋毛虫地理株（河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株）进行分子鉴定。结果T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ（MseⅠ）酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型：T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp。结论我国7个旋毛虫地理株的COXⅠ基因片段（92、70和22 bp）存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的　克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。　方法　根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论　成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。     

微小隐孢子虫LDH基因的克隆与序列分析

目的克隆微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,Cp)南京株(NJ)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因,测序并分析微小隐孢子虫NJ株CpLDH与其他隐孢子虫分离株LDH基因序列的差异。方法根据微小隐孢子虫已知LDH 基因序列设计合成2对引物, 应用巢式PCR 技术从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA 中扩增LDH 基因, 并将其克隆到pMD18 T 载体上,阳性克隆的重组质粒经PCR及双酶切鉴定后, 用双脱氧链终止法对重组质粒中的插入序列进行测序,应用生物信息学方法分析 CpLDH 基因序列和其他物种LDH序列的同源性。结果巢式PCR 扩增得到特异的CpLDH 基因序列,经PCR及双酶切鉴定获得了正确的pMD18 T CpLDH 重组质粒。测序表明, NJ株微小隐孢子虫LDH 基因全长966 bp, 编码322个氨基酸,该基因序列已登录GenBank,登录号为 HM001298。序列分析表明, 我国微小隐孢子虫NJ株与国外分离的Iowa II株 LDH基因编码的氨基酸序列具有98%的同源性。结论成功克隆了微小隐孢子虫NJ株LDH 基因;序列测定及同源性分析表明, 微小隐孢子虫NJ株在LDH酶关键结构位点存在突变。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与生物学分析北大核心CSCD

目的从四川省某规模化养猪场病死猪肝脏分离到一株奇异变形杆菌,分析其生物学特性,为临床鉴别诊断和治疗提供参考。方法对分离株进行革兰氏染色、培养特性观察、毒力试验、生化试验、药敏试验以及16SrRNA基因序列分析,并且构建系统进化树。结果分离株16SrRNA测序结果经BLAST对比分析,其与各株奇异变形杆菌同源性均为98%以上,将分离株与GenBank中其他6株不同来源的变形杆菌与3株不同来源的肠杆菌科细菌进行序列对比分析并且构建系统进化树,证明分离株与猪源奇异变形杆菌（HQ259935.1）的同源性最高,为99.8%;与大肠杆菌,沙门氏菌,克雷伯氏菌的同源性仅为92.1%~93.2%。致病性试验表明分离株对小鼠LD50为1.86×106 CFU/只。分离株对氨基糖苷类和β-内酰胺类药物中度敏感,对其他种类药物敏感性较低。结论分离株经鉴定为猪源奇异变形杆菌,具有较高的耐药性和致病性。     

河南省商丘地区猪旋毛虫感染调查

目的了解河南省商丘地区猪的旋毛虫自然感染情况。方法在河南商丘某县农村的3个生猪屠宰点,收集屠宰猪的膈肌样本,分别应用压片镜检法和人工消化法对肌肉样本进行旋毛虫检验。结果 273头屠宰猪均为圈养猪,肌肉样本应用镜检法与消化法的幼虫检出率分别为0（0/273）与3.30%（9/273）（χ2=7.230,P〈0.05）,阳性肉样的平均每g肌肉虫荷（larvae per gram,lpg）为0.48。结论河南省商丘地区农村圈养猪的旋毛虫感染率较高,但感染度较低;在旋毛虫病低度流行区应使用消化法对猪肉进行旋毛虫检验。     

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR)检测微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。　方法用 Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊。用酚 -氯仿法抽提卵囊总 DNA。针对本虫 18S r RNA基因片段设计 1对引物 ,对模板 DNA进行 PCR扩增 ,同时以蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫 (Trichinella spiralis) ,以及人体血细胞等 DNA样本为对照。用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对 PCR产物进行检测。　结果　仅微小隐孢子虫 DNA被扩增出一 5 0 0 bp的 DNA片段。其它对照 DNA样本均未出现扩增反应。　结论　PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达 10 0 % ,敏感性也很强 ,可检测到 2 0 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA。表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的 PCR方法有效     

Verification of clinical samples, positive in AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae polymerase chain reaction, by 16S rRNA and gyrA compared with culture

We compared 956 samples for AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae polymerase chain reaction (PCR) (Roche) with species verification using the 16S rRNA gene to verification using gyrA gene. Control was the culture method. The gyrA verification uses pyrosequencing of the quinolone resistance-determining region of gyrA. Of 52 samples with optical density >/=0.2 in PCR, 27 were negative in culture, two samples from pharynx were false negative in culture and four samples from pharynx were false positives in verification with 16S rRNA. Twenty-five samples showed growth of gonococci, 18 of the corresponding PCR samples were verified by both methods; three urine samples were positive only in gyrA ; and one pharynx specimen was positive only in 16S rRNA. Three samples were lost. We conclude that AMPLICOR N. gonorrhoeae PCR with verification in gyrA gene can be considered as a diagnostic tool in populations with low prevalence of gonorrhoea and that pharynx specimens should not be analysed by PCR.     

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的　对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法　采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果　T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论　中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3、T7分为另两大类     

基于COI与18S rRNA基因序列的4种肉食螨DNA条形码研究

目的　基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）与核糖体18S小亚基（18S rRNA）基因序列,分析确定4种肉食螨合适的DNA条形码,从而进一步完善肉食螨DNA条形码数据库。方法　2018年5月—2019年7月于安徽省阜阳、芜湖、铜陵等3市小型面粉作坊采集分离肉食螨样本,经形态学鉴定后,提取单个螨基因组DNA,经PCR扩增、克隆和测序获得COI与18S rRNA基因序列,所获序列进行BLAST比对。结合已报道肉食螨序列,用ClustalX 1.83软件进行多序列比对,基于MEGA X软件进行序列分析并计算遗传距离,采用最大似然法构建系统发育树。结果　马六甲肉食螨、转开肉食螨、鳞翅触足螨分子鉴定结果与形态学一致,而GenBank中缺少网真扇毛螨相关序列。4种肉食螨COI与18S rRNA 基因序列（A + T）分别为69.6%和55.1%,碱基替换数分别为137对和46对。基于COI与18S rRNA基因序列变异位点分析,发现4种肉食螨种间变异位点分别为154 ~ 321个和58 ~ 99个。4种肉食螨COI与18S rRNA基因序列种内遗传距离均≤ 0.020,种间遗传距离分别为0.235 ~ 0.583和0.078 ~ 0.114。基于COI与18S rRNA基因序列的系统发育树显示,4种肉食螨均能各自聚为一支,支持率均达100%,与形态学鉴定结果一致。结论　线粒体COI基因序列作为4种肉食螨DNA条形码优于18S rRNA基因序列,更适用于探索肉食螨的属、种低阶元亲缘关系。     

湖南省怀化地区山羊胰阔盘吸虫线粒体pcox1基因和核糖体18S rRNA基因序列遗传变异研究

目的　了解湖南省怀化地区山羊体内分离的胰阔盘吸虫遗传变异情况。方法　应用PCR技术对分离自湖南怀化地区山羊体内的18株胰阔盘吸虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因部分序列（pcox1）和核糖体18S rRNA基因进行扩增,对扩增产物进行测序并进行遗传变异和系统发育分析。结果　分离自湖南怀化地区山羊体内的18株胰阔盘吸虫分离株pcox1和18S rRNA基因序列长度分别为430 bp和1 857 bp,分别存在14个和35个变异位点,种内遗传差异分别为0 ~ 1.4%和0 ~ 0.8%;与GenBank数据库中收录的胰阔盘吸虫中国株基因序列同源性最高,分别为99.0% ~ 99.8%和99.5% ~ 99.8%。基于两种基因构建的系统发育树分析结果一致,本研究获得的18株胰阔盘吸虫分离株与GenBank数据库中已知胰阔盘吸虫分离株聚为同一分支,与支睾阔盘吸虫等阔盘属吸虫相隔较近,与其他吸虫所属分支相隔较远。结论　湖南省怀化地区山羊源胰阔盘吸虫分离株遗传变异度较低,线粒体pcox1基因和核糖体18S rRNA基因均适合作为羊源胰阔盘吸虫遗传变异研究的分子标记。