PKC及缝隙连接蛋白Cx43改变在吗啡和舒芬太尼预处理缺氧复氧损伤心肌中的作用

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）信号通路及心肌缝隙连接蛋白Cx43改变在阿片药物预处理中的作用。方法：原代心肌细胞分离培养。将培养5 d的心肌细胞分成8组。正常对照组（C组）不给予任何处理,建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型（I/R组）,吗啡组（MF组）加入吗啡至终浓度0.3 μmol·L^-1,舒芬太尼组（SF组）加入舒芬太尼至终浓度0.000 3 μmol·L^-1,PKC激动剂PMA+吗啡组（PMA+MF组）加入PMA至终浓度0.02 μmol·L^-1,再进行吗啡预处理;PKC抑制剂Rottlerin+吗啡组（ROT+MF组）加入Rottlerin至终浓度5 μmol·L^-1,再进行吗啡预处理;PKC激动剂PMA+舒芬太尼组（PMA+SF组）加入PMA至终浓度0.02 μmol·L^-1,再进行舒芬太尼预处理;PKC抑制剂Rottlerin+舒芬太尼组（ROT+SF组）加入Rottlerin至终浓度5 μmol·L^-1,再进行舒芬太尼预处理。各组做上述相应处理后取材检测细胞存活率。免疫荧光共聚焦技术检测缝隙连接蛋白Connexin 43（Cx43）的平均光密度（AOD）,用Western-blot检测细胞Cx43总蛋白及其磷酸化水平（P-Cx43）的表达量。结果：与C组比较,其余各组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、心肌细胞Cx43总蛋白表达及P-Cx43表达降低（P<0.05）;与I/R组比较,MF组、SF组、ROT+MF组、ROT+SF组、PMA+MF组、PMA+SF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达增高（P<0.05）;与MF组比较,ROT+MF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白及P-Cx43表达降低（P<0.05）,SF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值和Cx43总蛋白降低（P<0.05）,而P-Cx43表达增高（P<0.05）,PMA+MF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达均增高（P<0.05）;ROT+SF组较SF组心肌细胞Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达低（P<0.05）,而PMA+SF组较SF组心肌细胞存活率、心肌细胞Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达高（P<0.05）。结论：吗啡和舒芬太尼预处理可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,且吗啡对心肌细胞的保护作用较舒芬太尼强,这种心肌细胞保护作用可能与PKC信号通路的激活有关。     

丹参酮IIA通过PKC/Cx43通路减轻大鼠心肌缺血再灌注致心律失常

目的 探讨丹参酮II_A（TA）对再灌注致心律失常的改善作用及机制。方法 取60只SD大鼠随机分为6组：对照组，模型组，TA低、高剂量（10、20 mg·^kg-1）组，蛋白激酶C （PKC）激活剂PMA （5 mg·^kg-1）组，TA （20 mg·^kg-1）联合PKC抑制剂Rottlerin （5 mg·^kg-1）组，每组10只。构建SD大鼠心肌缺血再灌注（I/R）模型，缺血30 min再灌注30 min；再灌注期间记录各组小鼠Ⅱ导联心电图并对再灌注后心律失常严重性进行评分；再灌注结束后，取颈静脉血采用试剂盒检测心肌损伤指标肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）和心肌肌钙蛋白（cTnT）水平；取左心室心脏组织，使用试剂盒检测丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测PKC、缝隙连接蛋白43（Cx43）mRNA表达，Western blotting法检测PKC、Cx43蛋白表达水平和磷酸化水平。结果 与模型组比较，TA 2个剂量组和PKC激活剂PMA组CK-MB、LDH、AST、cTnT、MDA水平均显著降低，SOD活性显著升高，室性早搏（PVB）次数、室性心动过速（VT）次数和持续时间以及心室颤动（VF）次数和持续时间显著减少，心律失常评分显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05、0.01、0.001） ；而TA联合PKC抑制剂组显著削弱TA的作用（P＜0.05、0.01、0.001） ；与模型组相比，TA 2个剂量组和PMA组Cx43 mRNA表达和磷酸化水平显著升高（P＜0.01、0.001） ，而PKC抑制剂使TA的作用显著减弱（P＜0.05、0.001）。结论 TA通过激活PKC调控Cx43表达和磷酸化而改善再灌注后心律失常，减轻心肌I/R损伤。     

槲皮素对自发性高血压大鼠大脑中动脉张力与缝隙连接蛋白43表达的影响

目的研究槲皮素对自发性高血压大鼠(SHR)大脑中动脉张力的影响及其与缝隙连接蛋白43(Cx43)的关系。方法取WKY大鼠作为正常对照组(每日给予正常饮水摄食);按照体重将SHR大鼠随机分为2组:模型组(每日给予正常饮水摄食)和实验组(每日给予槲皮素50 mg·kg^-1,ig),每组10只。8周后,以血管张力测定法检测大鼠大脑中动脉对血管舒缩剂的反应性,用逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法检测大鼠大脑中动脉的Cx43 mRNA和Cx43蛋白表达水平。结果 U46619(血栓素A2类似物)收缩后,正常对照组、模型组和实验组的最大收缩百分比分别为(43. 15±3. 42)%,(100. 00±0. 00)%和(67. 38±4. 26)%; KCl收缩后,这3组大鼠的最大收缩百分比分别为(37. 23±5. 01)%,(100. 00±0. 00)%和(60. 23±4. 52)%,正常对照组和模型组比较或者模型组和实验组比较,这2种收缩的差异均有统计学意义(P <0. 05,P <0. 01)。硝普钠舒张后,这3组大鼠的最大舒张百分比分别为(85. 16±4. 23)%,(50. 25±3. 17)%和(75. 18±3. 06)%;吡那地尔舒张后,这3组大鼠的最大舒张百分比分别为(83. 25±4. 37)%,(53. 06±3. 53)%和(70. 23±4. 21)%,正常对照组和模型组比较或者模型组和实验组比较,这2种舒张的差异均有统计学意义(P <0. 05,P <0. 01)。这3组大鼠大脑中动脉的Cx43 mRNA表达量分别为0. 63±0. 12,1. 30±0. 17和0. 80±0. 15,正常对照组和模型组比较或者模型组和实验组比较,差异均有统计学意义(均P <0. 01);这3组大鼠大脑中动脉的Cx43蛋白表达趋势与mRNA结果一致。结论槲皮素可以通过抑制大脑中动脉的Cx43表达改善SHR大脑中动脉的张力异常。     

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠下丘脑信号通路的影响

目的 研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠下丘脑sigma-1受体/蛋白激酶C（sigma-1 receptor/protein kinase C,sigma-1R/PKC）信号通路的影响。方法 建立糖尿病并发抑郁症的动物模型,并随机分为4组：模型组、阳性药组、左归降糖解郁方高剂量组（20.53 g·kg^-1）、左归降糖解郁方低剂量组（10.26 g·kg^-1）,另设健康SD大鼠为正常组。灌胃给药28 d后,各组大鼠尾静脉取血检测血糖含量,开野试验检测大鼠的自主活动能力,HE染色检测大鼠下丘脑的病理损伤情况,ELISA法检测大鼠下丘脑匀浆液中促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropin releasing factor,CRF）含量,Western-blot法检测大鼠下丘脑中sigma-1R蛋白表达以及PKC,糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）蛋白的磷酸化水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠血糖含量显著升高而活动能力显著减弱（P<0.01）,下丘脑中CRF含量显著升高（P<0.05）而sigma-1R的表达以及p-PKC/PKC,p-GR/GR比值显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较,左归降糖解郁方高剂量组大鼠血糖含量显著降低（P<0.05）,活动能力增强（P<0.01）,下丘脑中CRF含量显著降低而sigma-1R,p-PKC/PKC,p-GR/GR显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论 高剂量左归降糖解郁方可有效调节sigma-1R水平,并通过激活sigma-1R/PKC信号通路,降低模型大鼠下丘脑中CRF的含量,从而发挥降血糖和抗抑郁的双重作用。     

缝隙连接在缺血后处理保护大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及可能机制

目的：探讨缝隙连接在缺血后处理保护大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其可能的机制。方法：60只雄性SD大鼠随机分为假手术（sham）组、缺血再灌注（ischmia／reperfusion,I／R）组、缺血后处理（ischemicpost—conditioning,IP0）组、甘珀酸（carbenox010ne,CBX）干预缺血再灌注（I／R＋CBX）组和甘珀酸干预缺血后处理（IPO＋CBX）组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型;Longgs法进行神经功能评分;TTC染色法和HE染色法分别检测大鼠脑梗死体积和脑组织形态学变化;WesternBlot法检测脑组织中缝隙连接蛋白43（Cx43）、蛋白激酶C（PKC）蛋白的表达。结果：与sham组相比,I／R组神经功能评分显著增高,脑梗死体积增大,细胞排列紊乱、胞核固缩等组织形态学改变显著;IP0可使I／R组损伤减轻;CBX可以进一步增强IPO对I／R损伤的保护作用。WesternBlot结果显示,I／R组较sham组Cx43表达增多,PKC表达降低;IPO组较I／R组Cx43表达降低（P〈0．01）,PKC表达增高（P〈O．01）,同时,IPO＋CBX组较IPO组也有类似的改变。结论：IPO可通过抑制缝隙连接而减轻I／R损伤,其机制可能与影响PKC蛋白的表达有关。     

糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞膜G蛋白基因表达的变化

目的 探讨胃平滑肌细胞内信号传导异常在糖尿病胃轻瘫发病机制中的作用.方法 健康雄性SD大鼠20只随机分为两组,每组10只,分别为健康对照组、糖尿病模型组,四氧嘧啶50 mg/kg静脉注射1次,建立大鼠糖尿病模型,健康对照组仅注射等量0.9%氯化钠注射液.营养性半固体米糊法测定胃排空率.放射免疫方法测定胃平滑肌细胞cAMP含量.核酸原位杂交方法和计算机图像分析系统对平滑肌细胞的Gsα、Giα mRNA的表达进行定量分析.结果 (1)胃排空率:模型组较对照组明显减低(P<0.05);(2)胃平滑肌cAMP含量:模型组较对照组明显增高(P<0.05);(3)Gsα、Giα的基因表达量:Gsα mRNA阳性物质星棕黄色颗粒,位于平滑肌细胞胞浆内,模型组的表达量明显高于健康对照组(P<0.05);Giα mRNA阳性物质呈亮红色颗粒,位于胞浆内,两组之间的表达量差异无统计学意义(P>0.05).结论 糖尿病大鼠胃平滑肌Gsα mRNA的表达量变化可能在糖尿病胃轻瘫的发病机制中起一定作用.     

替加色罗与莫沙必利治疗糖尿病胃轻瘫疗效比较

目的：比较替加色罗与莫沙必利治疗糖尿病胃轻瘫的疗效。方法：65例糖尿病胃轻瘫患者随机分为治疗组（33例）及对照组（32例）。两组均予控制饮食、适宜运动,同时注射胰岛素或口服抗糖尿病药控制血糖。在此基础上,治疗组加用替加色罗片6 mg,po bid,对照组加用莫沙必利片5 mg,po tid。均为饭前30 min口服。两组疗程均为4周。观察两组4周后临床疗效及治疗后6个月、1年的复发率。结果：治疗4周后,治疗组总有效率为93.94%,明显优于对照组总有效率71.88%（P〈0.05）。治疗组6个月和1年的复发率也明显低于对照组（P〈0.05）。结论：替加色罗治疗糖尿病胃轻瘫临床疗效较好,明显降低复发率。     

缝隙连接及其连接蛋白对血管加压素诱导的失血性休克大鼠血管收缩的作用研究

摘要：目的 观察缝隙连接（GJ）及其组成亚单位连接蛋白（Cx）在血管加压素（AVP）诱导失血性休克大鼠血管收缩中的作用。方法 采用失血性休克大鼠模型和缺氧培养血管平滑肌细胞（VSMC）,观察GJ阻断剂CBX和octanol、以及各Cx亚型反义寡核苷酸（AODN）对AVP诱导的血管收缩反应的影响,随后进一步观察参与AVP作用的Cx37和Cx43对AVP调节休克血管钙敏感性和缺氧VSMC内钙离子浓度的影响。结果 GJ阻断剂CBX和octanol明显抑制了AVP诱导的休克血管的收缩反应。在所有血管中表达的连接蛋白中,Cx37AODN和Cx43AODN明显抑制了AVP的血管收缩作用。进一步结果显示,Cx43AODN、而不是Cx37AODN,可拮抗AVP升高休克血管钙敏感性的作用。此外, AVP处理和干扰Cx37及Cx43对缺氧VSMC内钙离子浓度无明显影响。结论 缝隙连接在休克后AVP介导的血管收缩调节中有重要作用,Cx37和Cx43参与了这一过程,其中Cx43可能通过影响AVP介导的血管钙敏感性调节途径来发挥作用,而Cx37可能通过其它机制来参与AVP的血管调节作用。     

黄芩苷对心力衰竭大鼠心律失常及心室肌细胞内质网应激-肌电稳定性的影响

目的　探究黄芩苷对心力衰竭大鼠室性心律失常及心室肌细胞内质网应激-肌电稳定性的影响。方法　雄性6周龄Wistar大鼠72只,随机分为对照组,模型组,美托洛尔组,黄芩苷低、中、高剂量组,每组12只。模型组给予异丙肾上腺素（ISO）后颈部皮下注射5 mg/（kg·d）,对照组给予等体积0.9%NaCl注射液后颈部皮下注射,连续注射7 d;美托洛尔组及黄芩苷低、中、高剂量组在模型组基础上分别给予美托洛尔10 mg/（kg·d）及25、50、100 mg/（kg·d）黄芩苷灌胃,对照组给予药物等体积0.9%NaCl注射液灌胃,连续给药4周。于4周末行心电图及多普勒超声检测各组大鼠心率、室性早搏发生情况及测定左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）;酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组大鼠血清人基质裂解素2（ST2）、脑钠肽（BNP）含量。每组取6只大鼠制备Langendorff离体心脏灌注模型,记录和测量心肌单相动作电位复极90%的时程（MAPD90）、心室肌细胞有效不应期（ERP）及ERP/MAPD90比值;另外6只大鼠行心室肌TUNEL染色后检测其心肌细胞凋亡情况;Western blot检测各组大鼠心室肌细胞葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、肌醇需酶1（IRE1）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）及缝隙连接蛋白43（Cx43）蛋白表达。结果　与对照组比较,模型组大鼠心率增快,易发生室性早搏,LVESd、LVEDd升高,LVEF降低,血清ST2、BNP含量升高,心室肌细胞ERP/MAPD90降低,凋亡指数（AI）升高,GRP78、IRE1、CHOP表达升高,Cx43表达降低（均P＜0.05）;与模型组比较,黄芩苷低、中、高剂量组上述指标均明显改善,且呈剂量依赖性（P＜0.05）。结论　黄芩苷具有改善ISO所致心力衰竭大鼠室性心律失常及心功能的作用,其机制可能与抑制心室肌细胞内质网应激及细胞凋亡、提高肌电稳定性相关。     

大腹皮等七味中药对豚鼠离体胃纵行肌条的作用影响

目的观察大腹皮、蒲公英、莱菔子、白术、小茴香、莪术、香附等七味中药对豚鼠离体胃纵行肌条的收缩作用，以探讨归脾、胃经的不同性效中药的作用规律。方法制备豚鼠胃底胃体平滑肌条，以生理盐水（NS）和乙酰胆碱（Ach）作对照，观察中药大腹皮、蒲公英、莱菔子、白术、小茴香、莪术、香附对离体胃纵行平滑肌的收缩效应。结果七味中药对胃底胃体纵行肌条均有不同程度的兴奋作用？与生理盐水组比较，有显著性差异（P〈0．01）。以Ach标化实验数据，莱菔子的收缩作用最强，与其他五味中药比较，有统计学差异（P〈0．05），但与大腹皮无统计学差异（P〉0．05）。白术、蒲公英、小茴香的作用次之，无论在胃体还是胃底，莪术和香附的收缩作用均稍弱，与其他五味药比较挚有差异（P〈0.05）。结论在促进胃平滑肌收缩方面从性味看辛温药物较强，其次是苦甘味药物。将性味归经理论用于促胃动力研究是一个中西医结合药物研究的有效途径。     

Uremic toxin p-cresol induces disassembly of gap junctions of cardiomyocytes

High serum levels of p-cresol have been associated with cardiovascular diseases. This study investigated the effects of p-cresol on gap junctions in neonatal cultured cardiomyocytes. p-Cresol reduced the spontaneous contraction rates of cardiomyocytes, and caused irregular cardiomyocyte beating. Junctional connexin 43 (Cx43) plaques became smaller in size and the gap junction intercellular communication (GJIC) impaired. Moreover, p-cresol increased intracellular Ca(+2) levels, and induced Ca(+2)-dependent protein kinase Cα (PKCα) activation. p-Cresol decreased P1 and P2 Cx43 levels, and increased non-phosphorylated S368-Cx43 levels. The above changes as well as Cx43 disassembly and GJIC decrease induced by p-cresol were prevented by the BAPTA-AM or PKCα inhibitor G?6976. These results suggest that PKCα mediates p-cresol-induced gap junction disassembly and GJIC dysfunction via S368-Cx43 serine dephosphorylation. This hypothesis was further confirmed in H9c2 cells by siRNA approach. SiRNA knockdown of PKCα prevented p-cresol-induced increase in nonphosphorylated Cx43. This finding supports the association of p-cresol and cardiovascular diseases.     

色满卡林对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的：观察色满卡林对自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响。方法：30只12 wk龄SHR,随机分为高血压组、色满卡林组,另设正常对照组。色满卡林组给予色满卡林0.6 mg·kg~(-1)·d~(-1),分2次灌胃；另2组每日给予等量的生理盐水,共16 wk。监测尾动脉收缩压。用免疫组化法检测Bcl-2,Bax和PCNA蛋白表达。荧光标记TUNEL法检测VSMCs凋亡,计算VSMCs凋亡指数(SMAI)。结果：高血压组与正常对照组比较,收缩压明显增高(P＜0.05)；VSMCs中的Bcl-2,PCNA蛋白表达明显增强(P＜0.05)；SMAI明显减少(P＜0.01)；Bax蛋白表达2组间差异无显著意义(P＞0.05)。与高血压组比较,色满卡林组尾动脉收缩压呈降低趋势,但差别无显著意义(P＞0.05)；VSMCs的Bcl-2和PCNA蛋白的表达减少(P＜0.05),Bcl-2/Bax比值下降；SMAI增加(P＜0.05)。结论：色满卡林促进了SHR的VSMCs凋亡,可能机制是通过调节VSMCs的Bcl-2/Bax蛋白表达平衡。     

理脾复方制剂对大鼠胃窦平滑肌细胞神经肽Y和八肽胆囊收缩素表达的影响

目的 观察理脾复方制剂治疗小儿厌食症的可能作用机制.方法 60只SD大鼠随机分为生理盐水组,理脾复方制剂低、中、高剂量组,硫酸锌组与细胞培养组共6组,每组10只.细胞培养组主要用于培养原代大鼠胃窦平滑肌细胞,其余各组分别灌胃给药理脾复方制剂、硫酸锌7d,每日1次,于末次灌胃1h后进行麻醉下股动脉采血,制备含药血清.将各...     

PKCɛ mediates serine phosphorylation of connexin43 induced by lysophosphatidylcholine in neonatal rat cardiomyocytes

Lysophosphatidylcholine (LPC) is a potent pro-arrhythmic derivative of the membrane phosphotidylcholine, which is accumulated in heart tissues during cardiac ischemia. However, the cellular mechanism underlying LPC-induced cardiomyocyte damage remains to be elucidated. This study focuses on the effects of LPC on cardiomyocyte gap junction. At 30 μM, LPC decreased the spontaneous contraction rates of cardiomyocytes, and caused arrhythmic contraction without affecting cell viability. Connexin43 (Cx43) was seen as large plaques at cell junctions in control cells, whereas upon LPC treatment, the intensity of Cx43 staining was decreased in a concentration-sensitive manner and Cx43 staining appeared as tiny dots at cell junctions with a corresponding increase in cytoplasmic punctate staining. This distributional change of Cx43 was accompanied by an impairment of the gap junction intercellular communication (GJIC). Further, LPC treatment induced protein kinase C (PKC) activation, and PKC-dependent Cx43 phosphorylation at serine (Ser) 368. Pre-treatment with a specific PKC? inhibitor, eV1-2, prevented the LPC-induced Cx43 phosphorylation at Ser368 and the loss of Cx43 from gap junctions, both of which may disturb GJIC functions. Furthermore, siRNA knockdown of PKC? in H9c2 cells prevented LPC-induced serine phosphorylation of Cx43, confirming the role of PKC? in Cx43 serine phosphorylation. Double labeling immunofluorescence showed that LPC increased the colocalization of Cx43 with ubiquitin, and pretreatment with MG132 effectively prevented LPC-induced gap junction disassembly. LPC increased the ubiquitination of Cx43, which was blocked by eV1-2 pretreatment, suggesting that LPC accelerated the intracellular degradation of Cx43 via the ubiquitin-proteasomal pathway. It can be concluded that LPC destroyed the structure and function of gap junctions via PKC?-mediated serine phosphorylation of Cx43. PKC? inhibitors might therefore be effective in prevention of LPC-related diseases.     

罗格列酮对哮喘小鼠气道重塑模型气道平滑肌肌动蛋白-α表达的影响

目的探讨哮喘小鼠气道平滑肌肌动蛋白-α（SMA-α）表达与气道重塑的关系,评价罗格列酮治疗对两者的影响。方法将BALB/C小鼠32只随机分为正常对照组（A组,n=8）、哮喘模型组（B组,n=8）、哮喘模型地塞米松雾化吸入干预组（C组,n=8）、哮喘模型罗格列酮雾化吸入干预组（D组,n=8）。采用SABC法免疫组化技术和计算机图像分析系统对小鼠气道SMA-α表达和气道重塑进行研究。结果 （1）与A组比较,B组小鼠气道平滑肌（ASM）厚度和上皮厚度均显著增加（P〈0.05）,而气道直径显著减小（P〈0.05）;C、D组ASM厚度和上皮厚度均增加（P〈0.05）,气道直径减小（P〈0.05）。（2）与B组比较,C、D组小鼠ASM厚度和上皮厚度均显著下降（P〈0.05）,而气道直径显著增大（P〈0.05）;C、D组上述指标比较差异无统计学意义（P〉0.05）。（3）与A组比较,B、C、D组小鼠气道SMA-α表达水平显著升高（P〈0.05）;与B组比较,C、D组小鼠气道SMA-α表达水平显著下降（P〈0.05）;C、D组SMA-α表达水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论气道SMA-α表达水平的上调可能是导致气道重塑反应发生的机制之一,罗格列酮治疗可延缓该反应的发生。     

辛伐他汀抑制大鼠心肌细胞TNF-α的表达及其与活性氧的关系

目的:探讨辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞TNF-α表达的影响及其分子机制.方法:以培养的新生SD大鼠心肌细胞为实验模型,应用RT-PCR和ELISA检测TNF-α mRNA和蛋白表达水平,采用荧光探针二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)测定细胞内活性氧(ROS)水平,通过细胞色素C还原试验测定还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性.结果:LPS组心肌细胞TNF-α mRNA和蛋白表达水平分别为(0.29±0.07)、(83.6±14.5)pg/mL,与对照组(0.07±0.02)、(22.1±7.1)pg/mL比较显著升高(P＜0.01).1 μmol/L和10 μmol/L辛伐他汀干预下TNF-α mRNA水平为0.18±0.05、0.15±0.02,蛋白含量为(43.1±8.3)、(40.1±7.3)pg/mL,与IPS组比较显著降低(P＜0.01).在抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸和二亚苯基碘鎓预处理后,TNF-α蛋白含量分别为(39.1±10.2)、(37.9±8.9)pg/mL,与LPS组比较均显著降低(P＜0.01).LPS组DCF荧光强度为83±15,NADPH氧化酶活性为(246±43)%,均明显高于对照组(P＜0.01).辛伐他汀干预下DCF荧光强度为41±8,氧化酶活性为(120±17)%,与LPS组比较均显著下降(P＜0.01).在外源性H_2O_2刺激下,TNF-α蛋白含量为(65.0±17.2)pg/mL,与对照组比较显著升高(P＜0.01).辛伐他汀干预下TNF-α蛋白含量为(58.8±15.8)pg/mL,与H_2O_2,组比较变化相近(P＞0.05).在甲羟戊酸和辛伐他汀共同干预作用下,心肌细胞TNF-α mRNA和蛋白表达水平、ROS水平及NADPH氧化酶活性与辛伐他汀干预组比较均显著升高(P＜0.01),与LPS组比较变化相近(P＞0.05).结论:辛伐他汀能够抑制LPS诱导心肌细胞TNF-α表达的作用,其机制可能与降低NADPH氧化酶活性从而减少ROS的生成有关.     

Translocation of protein kinase C in bovine tracheal smooth muscle strips: the effect of methacholine and isoprenaline.

Investigations into the mechanisms involved in the contraction of smooth muscle have suggested that the generation of diacylglycerol and the activation of protein kinase C (PKC) may be important in the generation or maintenance of smooth muscle tone. The present study examined the possible role of PKC in the contraction of bovine tracheal smooth muscle. Methacholine (10 microM) induced a rapid elevation in PKC activity associated with the membrane fraction. PKC levels were significantly elevated in the membrane fraction 30 s after agonist addition, reached a maximum at 1 min and then declined to and remained at a lower level which was still elevated above basal. A concomitant decrease in cytosolic PKC activity of smaller magnitude was observed during this period of stimulation. This methacholine-induced re-distribution of PKC from the cytosol to the membrane was concentration-dependent and was blocked by atropine. Pre-treatment of tissues for 2 min with 100 microM isoprenaline prevented both the re-distribution of PKC and the contraction produced by 1 microM methacholine. Addition of 1 microM isoprenaline to tissues pre-contracted with 1 microM methacholine reversed the re-distribution of PKC produced during contraction and completely relaxed the tissues. Thus, under these conditions, translocation of PKC from the cytosol to the membrane seems to be well correlated with contractions of bovine tracheal smooth muscle. Whether the PKC translocation is responsible for the observed changes in muscle tone or whether the enzyme translocation is a result of drug-induced changes in [Ca2+]i, remains to be determined.     

高磷通过SET8调控p53/Bcl-2/Caspase信号通路促进血管平滑肌细胞钙化

摘要：目的 探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8在高磷诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化中的作用及机制。 方法 选取80～100 g的清洁雄性SD大鼠6只,取其胸主动脉,分离VSMCs后进行原代培养。VSMCs传至第3～4 代,铺6孔板,并给予相应刺激。将VSMCs随机分为正常组和高磷组（10 mmol/L β-甘油磷酸）,培养4 d后茜素红染 色观察钙结节形成情况,甲基麝香草酚蓝比色法钙含量,流式细胞数检测细胞凋亡,RT-PCR 和 Western blot 检测 SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白的表达水平。之后用脂质体将SET8-shRNA质粒与NS-shRNA转染 VSMCs 作为 SET8-shRNA 组和空质粒组,未转染组作为正常对照组,RT-PCR 和 Western blot 检测 p53、Bcl-2、Bax、 Caspase3的mRNA和蛋白的表达水平。结果 （1）高磷组钙盐沉积较正常组明显增加（P＜0.05）。（2）流式细胞仪检 测结果显示,与正常组相比,高磷组VSMCs的细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。（3）与正常组相比,高磷组Bcl-2、SET8 的mRNA和蛋白表达水平下降;p53、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。（4）干扰SET8基因表达 后钙盐沉积增加（P＜0.05）,Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平下降;p53、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白表达水平升高 （P＜0.05）。结论 高磷通过SET8调控p53/Bcl-2/Caspase信号通路,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调促凋亡蛋白 Bax和Caspase3的表达,进而参与调控VSMCs的钙化。