真核表达的重组猪单链IL-12生物学活性的研究

目的:真核表达重组猪单链IL-12(pscIL-12)并鉴定表达的pscIL-12的生物学活性。方法:采用梭华-SofastTM将pcDNA3.1(+)-pscIL-12转入CHO-K1细胞,ELISA法测定细胞培养上清中pscIL-12的表达水平;MTT法检测细胞培养上清对NK细胞杀伤作用的影响;ELISA法测定细胞培养上清刺激人PBMC分泌IFN-γ的水平;流式细胞术(FCM)检测细胞培养上清对人淋巴母细胞增殖水平的作用。结果:融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中表达产物pscIL-12融合蛋白含量较高;生物学活性鉴定表明:pscIL-12融合蛋白可增强NK细胞活性、提高IFN-γ的产生和促进人淋巴母细胞的增殖。结论:转染pcDNA3.1(+)-pscIL-12质粒的CHO-K1细胞成功表达了具有良好生物学活性的pscIL-12。     

rhIL-1β对γ射线急性照射小鼠淋巴细胞增殖的影响

<正>一定剂量范围的γ射线可使机体在一定时间内免疫功能低下,并出现感染等一系列的并发症。白细胞介素-1（IL-1）主要是由单核巨噬细胞产生,研究发现它对多种免疫活性细胞有重要调节作用,并诱导这些细胞产生对肿瘤细胞的细胞毒活性。本研究采用MTT比色法,观察了重组人IL-1β（rhIL-1β）对γ射线照射小鼠淋巴细胞增殖的影响。     

人白介素24腺病毒载体构建及其生物学活性分析

目的：克隆人白介素24基因，构建其腺病毒载体，获取病毒重组子，并研究其生物学括性。方法：用密执毒素（Mezerein）诱导HeLa细胞表达IL-24，通过RT-PCR获取IL-24 cDNA，将其亚克隆至pAdTrack-CMV载体，经PmeⅠ线性化后，与腺病毒的骨架载体pAdEasy-Ⅰ在BJ5183菌中同源重组，HEK293细胞包装扩增，PCR、Western blot鉴定。AdIL-24处理宫颈癌CaSki细胞，通过MTT细胞存活实验检测其活性；Hoeehst33342染色、流式细胞仪检测凋亡；WesternNot检测Bax、Bd。2、p53蛋白的表达。结果：获取人IL-24的cDNA，序列与GeneBank公布序列完全一致，成功构建腺病毒载体，AdIL-24对CaSki细胞具有抑制生长、促进凋亡的作用，并上调Bax、p53蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达。结论：成功构建人IL-24的重组腺病毒载体，其病毒重组子具有生物活性。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

检测重组人干细胞生长因子生物活性方法的改进

目的：比较检测重组人干细胞生长因子生物学活性的方法。方法：应用Mo7e细胞系MTT（四甲基偶氨唑盐）比色、^3H-TdR掺入方法和CFU-GM半固体检测技术，检测rhSCF和rhGM-CSF生物学活性。结果：Mo7e细胞系MTT比色方法检测重组人SCF生物学活性与半固体集落培养技术以及^3H-TdR掺入具有同样的灵敏度。结论：该方法为研究SCF作用于造血干细胞的机理、信号传导以及临床前期的研究，提供了一个必要的手段。     

重组人白细胞介素21的制备及免疫学活性分析

目的:纯化制备rhlL-21,并分析其免疫学活性.方法:在含重组质粒pGEX4T-2/IL-21的大肠杆菌DH5a中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度.用MTT法研究rhIL-21对T细胞增殖、NK细胞杀伤活性的影响.结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhIL-21纯度达95%.rhIL-21能促进T细胞增殖,能增强NK细胞杀伤活性.结论:成功制备了rhIL-21,其在体外具有一定的免疫学活性,为其大量制备和体内的生物学活性研究奠定了基础.     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

一种新型重组人源性白细胞介素-8活性检测方法的建立

目的通过蛋白质片段互补检测（proteinfragmentcomplementationassay，PCA）技术检测重组人源性IL-8的生物学活性。方法利用PCA方法构建了Split—TEVGPCR激活检测系统，为了验证其有效性，在不同的宿主系统中表达和纯化了各种亚型的人源性IL-8重组蛋白用于进行活性检测。蛋白样品包括：①IL-8亚型I（残基21-99），通过在哺乳动物细胞HEK293中分泌表达前体IL-8基因获得，其N端信号肽（残基1—20）被切除；②IL-8亚型Ⅱ（残基23—99）和亚型Ⅲ（残基28—99），通过在大肠杆菌BL21（DE3）中表达获得。结果Split—TEVGPCR激活检测系统证明纯化后的重组人源性IL．8样品对天然受体IL8RB都具有明显的激活活性，其EC50值分别为：12．32±0．89ng／mL（亚型I）、15．14±1．84ng／mL（亚型Ⅱ）和2．854-0．50ng／mL（亚型Ⅲ）。结论成功建立了-种新型的重组人IL-8活性检测方法，为进一步的理论研究和IL-8中和抗体的高通量筛选奠定了基础。     

组胺对T细胞IL-2产生及增殖活性影响的实验研究

目的:了解组胺对 CD4 和 CD8 T细胞IL-2产生和细胞增殖活性的影响。方法:密度梯度离心及吸附法分离PBMC和PBLC,采用抗CD4 和CD8 抗体分别制备CD8 和CD4 T细胞进行培养,然后采用ELISA法和MTT比色法测上清液IL-2含量及增殖活性。结果:①组胺 CD4 （CD8 ）培养上清液中IL-2水平及MTT增殖指数与T细胞自然培养孔比较明显降低（P<0.05）。②组胺 CD4 （CD8 ） 西咪替丁培养孔上清液中IL-2水平及 MTT增殖指数明显高于未加西咪替丁孔（P<0.05）。③CD4 T细胞自然培养孔上清液中IL-2水平显著高于CD8 T细胞自然培养孔。结论:组胺可抑制T细胞IL-2产生及增殖。西咪替丁可阻断组胺对T细胞的抑制作用。CD8 T细胞也可产生IL-2,但其功能较 CD4 T细胞为低。     

卡介苗(BCG)通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能

目的:研究卡介苗(BCG)对人自然杀伤细胞(NK)功能的作用及其机制.方法:分离抗结核抗体阴性志愿者外周血PBMC、纯化NK细胞, 分别与BCG、 IL-12、 BCG+IL-12、 BCG+抗IL-12Rβ1 mAb(2B10)培养.利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、 IL-12p40含量;利用ELISpot方法检测IFN-γ、颗粒酶B产生细胞的频率;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定杀伤功能.利用流式细胞术检测NK细胞IL-12Rβ1的表达.结果:BCG呈剂量依赖的方式诱导PBMC产生IFN-γ.在BCG刺激条件下, PBMC颗粒酶B分泌细胞数明显高于不加任何刺激剂组(P<0.05).BCG增强PBMC杀伤活性.BCG不能诱导纯化NK细胞产生IFN-γ, 但与IL-12同时刺激则表现出协同作用.纯化NK细胞经BCG刺激后杀伤活性与未刺激相比差异无统计学意义.BCG呈剂量依赖方式诱导PBMC产生IL-12、并促进NK细胞不同亚群表达IL-12Rβ1.2B10抗体抑制BCG对PBMC产生IFN-γ和分泌颗粒酶B的诱导作用.结论:BCG间接地促进NK细胞的生物学活性, 其部分机制是通过诱导单核细胞产生内源性IL-12、并上调NK细胞表达IL-12R.     

六味地黄丸含药血清减轻KCl诱导的PC12细胞损伤

 目的 观察六味地黄丸含药血清对KCl诱导PC12细胞损伤的影响。 方法 取对数生长期的PC12细胞,分为对照组、模型组、六味地黄丸含药血清组,采用KCl诱导PC12细胞损伤模型,观察细胞的形态和成长状况, MTT法测定细胞活性及乳酸脱氢酶（LDH）活力,用RT-PCR法检测细胞CREB mRNA表达,SABC免疫组化法检测细胞CREB的表达。结果 模型组细胞上清液中LDH活力显著增高于对照组（P<0.01）,细胞的CREB mRNA及蛋白表达显著减少（P<0.01）;六味地黄丸含药血清组细胞上清液中LDH活力较模型组显著降低（P<0.01）,细胞CREB mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清可减轻KCl诱导的PC12细胞损伤。     

IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响

目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepal-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响.方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL广1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体.利用transiT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepal-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用.结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822 bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepal-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对于扰素的抵抗性明显增强.结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1βp能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepal-6细胞的增殖抑制作用.     

重组腺病毒载体mIL-12治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

目的： 观察重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤的治疗效应.方法： 皮下注射B16黑色素瘤细胞给C57BL/6小鼠建立荷瘤模型.于瘤内注射重组腺病毒载体AdmIL-12治疗, 观察皮下肿瘤的生长及荷瘤小鼠的存活期.采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结果： 重组腺病毒载体AdmIL-12治疗后, 能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 明显延长荷瘤小鼠的存活时间, 增强荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结论： 重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤有显著的治疗效应.     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体蛋白的研究

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体 (mIL-4RA)蛋白.方法 PCR方法扩增小鼠IL-4 C118截断型基因,定向克隆入转移质粒pFastBacHTB中,转化感受态DH10Bac细胞,在DH10Bac细胞内重组pFastBacHTB与杆粒发生转座.筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染sf9昆虫细胞株,获取完整重组杆状病毒.反复感染sf9细胞,扩增病毒同时表达目的 蛋白;用ELISA方法进行蛋白鉴定并初步定量.结果 经核苷酸序列测定及PCR方法,鉴定成功获得含mIL-4RA基因的重组杆粒;通过杆粒转染后sf9细胞所表现出来的细胞病变,推断成功转染并获得重组杆状病毒;最后ELISA方法初步定量sf9细胞培养上清中mIL-4RA蛋白表达量为(1.15±0.12) ng/mL.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达mIL-4RA蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础,同时亦为其他蛋白质的真核表达提供了方法学的参考.     

IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠(H-2d)特异性免疫应答的影响

目的：观察IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠（H-2d）特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响.方法：用肌肉注射法将HBV核心区DNA疫苗、IL-12质粒和IL-18 质粒接种BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBc（IgG）及IgG亚类（IgG1、IgG2a）;LDH释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性.结果：免疫6周后,HBcAg DNA疫苗联合IL-12质粒、IL-18质粒和IL-12＋IL-18质粒组小鼠的血清抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0.05）,抗HBc IgG亚类以IgG2a占优.DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤率均高于对照组（P组）,其中C＋IL-18组和C＋IL-12＋IL-18组中CTL值明显高于C组,尤以C＋IL-12＋IL-18组中的CTL杀伤率最高.结论：IL-12和IL-18基因与HBcAg DNA疫苗联合免疫,不仅能增强HBcAg特异性体液免疫应答,而且能增强HBcAg特异性CTL的杀伤活性.     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

白细胞介素-18的研究进展（文献综述）

白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）是近年来新发现的细胞因子,结构及胞内信号转导通路与IL-1相似,功能与IL-12相似,对天然免疫和获得性免疫反应都有着重要的调节作用,可增强自然杀伤和T细胞的细胞毒效应、强效诱生干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）,从而发挥极强的防御功能、抗感染、抗肿瘤等生物学活性,并与肿瘤、变态反应性疾病等的发生发展密切相关。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白，获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10，插入到同样双酶切的表达载体pET32a，构建重组载体IL-10／pET32a，测序正确后转化E.coli BL21（DE3），不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白，SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达，ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确，诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx，同时也存在包含体融合蛋白，经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10，MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx，有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-2l全长cDNA及其在大肠杆菌中表达，并进一步检测其表达产物的功能。方法：抽取外周血，分离淋巴细胞；抗CD3抗体刺激后，提取总RNA，通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242bp，3′端425bp)，重组PCR扩增出IL-21全长cDNA：DNA测序正确后，将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a( )中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定，挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达：SDS—PAGE、Western blotting鉴定，亲和层析分离纯化得到M，为18600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白。透析法重折叠复性，MTT法测定其对T细胞增殖活性。结果：成功获得人IL-21全长cDNA，并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。