肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的；研究肿瘤坏死因子α（TNFα），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)对内皮细胞组织因子（TF）表达的影响，并探讨TF基因5‘上游序列在TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法：应用细胞原位杂交技术检测TF mRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光毒酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，检测及分析报告基因活性。结果：TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TF mRNA的表达增强。在TF基因上游序列－244／＋121bp存在时，TNFα，AngⅡ均可使转梁内皮细胞荧光素酶表达量明显增加，而在－111／＋121bp存在时TNFα，AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异，而且较－244／＋121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论：TF基因上游－244／－112bp序列的存在对TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

血管紧张素转换酶2基因转染对人内皮细胞MIF表达的影响

目的：探讨重组血管紧张素转换酶2（ACE2）基因转染对体外培养的人血管内皮细胞中由血管紧张素（Ang）II诱导的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的影响。方法:克隆和构建含人ACE2基因全长的重组质粒（pACE2），并将之转染入人血管内皮细胞中。分别采用实时定量PCR和Western印迹技术检测转染细胞中的MIF mRNA与蛋白表达情况。结果: Ang Ⅱ（100 nmol/L）和Ang IV（100 nmol/L）刺激后均可诱导人血管内皮细胞中MIF mRNA及蛋白表达增加（P<0.01）。pACE2基因转染可明显抑制内皮细胞中由Ang II和Ang IV诱导的MIF mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: ACE2基因过表达可明显抑制人内皮细胞中炎症介质MIF的表达，提示ACE2基因具有一定的抗炎症效应。通过调节ACE2基因的活性和表达，很可能为炎症相关疾病如动脉粥样硬化治疗提供新的策略。     

腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究

目的： 研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）表达的机制。方法: 构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞，将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化；检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果: GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分（9/11）缺失体的转录活性抑制，AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强，而对应的功能元件的转录活性降低。结论: 腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因 5’-上游调控序列的转录活性，扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮细胞组织因子(TF)表达的影响,并探讨TF基因5’上游序列在TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法:应用细胞原位杂交技术检测TFmRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,检测及分析报告基因活性。结果:TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TFmRNA表达增强。在TF基因上游序列-244/+121bp存在时,TNFα、AngⅡ均可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-111/+121bp存在时TNFα、AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异,而且较-244/+121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论:TF基因上游-244/-112bp序列的存在对TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

转录因子GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节Tie2基因的表达

目的：探讨在炎症刺激因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的炎症反应中转录因子GATA家族成员是否参与了Tie2基因的转录调控。方法: 采用实时定量PCR测定TNF-α作用前后人主动脉内皮细胞（HAECs）和肺动脉内皮细胞（HPAECs）中GATA家族成员GATA2、GATA3 mRNA的表达,利用荧光素酶活性检测研究GATA转录因子能否激活Tie2基因启动子,并采用电泳迁移变动分析（EMSAs）和超级迁移率变动试验（supershift）研究GATA转录因子是否通过与Tie2基因启动子结合,从而激活Tie2基因的表达。结果: TNF-α可诱导人血管内皮细胞HAECs和HPAECs中转录因子GATA2的表达,高表达的GATA2可与Tie2基因启动子上的（T/A）GATA(A/G)序列结合,激活Tie2基因启动子,从而上调Tie2基因的表达。结论: GATA转录因子家族成员GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节了Tie2基因的表达。     

转录因子Bach1对人微血管内皮细胞的作用研究

 目的:研究转录因子Bach1对人微血管内皮细胞功能的影响。方法: 利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）细胞转染技术下调内皮细胞Bach1表达;用Matrigel管腔形成实验检测内皮细胞体外血管新生的能力;用Transwell小室法检测细胞迁移;用CCK-8法测定细胞增殖;用实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA法检测细胞中血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）mRNA 和蛋白的表达情况;用转染报告基因的方法检测VEGF基因的转录活性。结果: 下调内皮细胞Bach1表达明显促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成能力,对内皮细胞增殖能力无明显影响;抑制Bach1表达促进内皮细胞HO-1 mRNA 和蛋白的表达,增加VEGF 转录活性及mRNA和蛋白的表达。结论: 抑制转录因子Bach1表达可增加内皮细胞HO-1和VEGF的表达,促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成,提示Bach1是负性调控血管新生的因子。     

内皮细胞应力反应元件的研究进展

内皮细胞能对力学刺激发生反应,流体切应力能直接调节内皮细胞基因的表达,现已发现内皮细胞内受切应力调节的基因有20多种。目前认为其调节机制是通过存在于基因的启动子内并且能够被切应力所诱导的启动基因转录的顺式调控元件－－应力反应元件来调节基因的转录。目前已知的应力反应元件至少涉及4种转录因子的结合位点及10余种受切应力调控的相关基因。这4种转录因子分别是：（1）NF－κB;（2）AP－1;（3）Egr-1和（4）SP1。对应力反应元件的基序及基序结合蛋白的鉴定有待进一步的深入,以后还可能有效的应力反应元件被发现。在采用基因疗法来调控血管壁不同区段基因表达这方面已进行了有益的探索,显示出良好的前景。     

血管紧张素II对血管内皮细胞三种转录因子作用的影响

目的和方法:分别采用凝胶迁移率改变法(EMSA)和Western-blot的方法从基因转录水平探讨AngII对血管内皮细胞株ECV304的影响。结果:(1)EMSA结果表明,AngII组核抽提物与3种探针的结合活性均高于正常对照组,与NF-κB,SP-1和AP-1探针结合活性分别为正常对照组的10.98倍,3.97倍和1.33倍,说明AngII对血管内皮细胞的作用机制可能与NF-κB,SP-1和AP-1等转录因子的转录活性增加有关。进一步证实NF-κB,AP-1在内皮细胞功能失调发病机制中的重要作用,同时发现转录因子SP-1也可能参与此过程。(2)Western-blot结果表明,AngII处理后细胞核内NF-κB含量明显增加,提示AngII能够增加血管内皮细胞转录因子NF-κB的核转位,进一步验证了EMSA的结论。而细胞核内SP-1和AP-1的含量较对照组略有增加,提示AngII对SP-1和AP-1的核转位无明显影响而可能主要是促进转录因子与相应顺式调控元件的结合活性。结论:AngII对内皮细胞3种重要的转录因子的活性有不同程度的影响,这在心血管疾病的发病中可能起着重要的作用。     

雌激素和高胰岛素调节胰岛素受体底物-1，2表达机制研究

目的：研究雌激素和高浓度胰岛素对胰岛素受体底物(IRS)-1和-2表达的分子机理。方法： 将IRS-1，2基因5′调控区克隆至含荧光素酶表达载体pGL3质粒，转染HeLa细胞，加雌激素（1 nmol/L）或高浓度胰岛素(100 nmol/L)培养，检测IRS-1，2基因5′调控区相对转录活性。结果： 高浓度胰岛素刺激细胞48 h，IRS-2基因5′调控区相对转录活性减低，IRS-1无明显差异；雌激素处理显著增加IRS-1，2基因5′调控区的相对转录活性。结论： 高胰岛素可能通过作用于IRS-2基因5′调控区中胰岛素作用元件，使其转录活性降低。而雌激素则通过作用于IRS-1，2基因5′调控序列，使其转录活性提高，增强其表达。     

热休克因子1对FasL的调控作用

目的研究人热休克因子l（HSFl）对Fas配体（FasL）启动子转录活性的影响。方法用在线启动子分析软件分析FasL启动子区转录因子结合位点;凝胶阻滞实验（EMSA）研究内源性HSFl与FasL启动子区的热休克元件（HSE）结合能力;将组成型活化的HSFl突变体与FasL启动子表达载体FasL—luc共同转染HeLa细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光索酶活性。结果在FasL启动子区发现HSE核心序列（nGAAnnTYCn）,HSFl可以与该HSE体外结合;荧光素酶活性测定发现HSFl明显上调FasL—luc转录活性,突变该HSE,则转录激活作用消失。结论HSFl对FasL具有转录调控作用。     

人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD226（PTA1）启动子及其5‘上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列，并分析人CD226基因5‘上游调控序列以及通过RT－PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD226基因在－375bp处和－130bp处可能有两个启动子，含有AP－1，Ets-1,Spl,P300,PU.1,PEA3等转录因子结合序列，在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD226基因表达受到多种转录因子和5‘端上游调控序列的调控。     

鉴定调控 L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的转录因子SP-1

目的:鉴定调控 L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的转录因子，进一步阐明非激素依赖型前列腺癌的发病机理。 方法:在鉴定L-plastin启动子近3’端－216到1序列片段存在明显的转录活性的基础上，利用TF SEARCH软件分析该片段的序列，寻找调控L-plastin表达的非甾体激素类转录因子，并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实结合于该片段的转录因子，利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子，并检测切除该片段序列后荧光素酶活性变化。 结果:TF SEARCH软件分析表明在距转录起始点-54--41 bp处含有SP-1转录因子结合位点GGTGGGGCGGGGA，凝胶滞后实验和超滞后实验表明SP-1是结合于L-plastin启动子3’端该序列的转录因子，删除SP-1结合位点后荧光素酶活性下降。 结论:SP-1是促进L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的重要调控因子。     

HTLV-1 Tax 蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（human T-cell leukemia virus 1,HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（ high mobility group box 1,HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质,通过real-time PCR和Western blot分析HMGB1 mRNA和蛋白质的表达情况;利用脂质体介导方法,将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN 和 TaxP 细胞,观察 HMGB1基因在不同 T 细胞中的转录活性;pCMV-Tax 与 pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞,观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响;染色体免疫共沉淀（ ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果 TaxP细胞中HMGB1 mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。 TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似,均表现出3号质粒（pHLuc3,含有-504～＋83 HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1/neo）最高,但是6号质粒（含有-1163～＋83 HMGB1区段）却表现出 TaxP 细胞 HMGB1的转录活性明显高于 TaxN 细胞。pCMV-Tax与pGL3-HMGB1-Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示,6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。 ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段。结论-504～-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区,Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。     

单核细胞增生李斯特菌毒力基因aroA启动子上阻碍PrfA转录调控元件的研究

目的 研究食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称LM)毒力基因启动子的结构特点及其与转录调控因子PrfA(positive regulatory factor A)蛋白之间的关系.方法 选取plcA和aroA两个毒力基因启动子作为研究对象,plcA基因启动子(PplcA)上含有一个高度保守的PrfA蛋白结合序列TYAACAAATGTFAA(PrfA-box)和-10区(TAAGAT),其转录表达受PrfA强调控;aroA基因不受PrfA调控,所利用的启动子ParoA1为非依赖于PrfA的肩动子,但是在紧邻ParoA1的下游区域却含有一个与PplcA相似的PrfA-box(TTAAAACATGTTAA)和一个-10区(TTTAAT),该区域疑似为依赖于PrfA的启动子,被命名为ParoA2.应用PCR定点突变和SOEing PCR(重叠区扩增基因拼接法)技术互换了PplcA和ParoA2上可能影响PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列PplcA-ParoA2杂合突变启动子,并插入到无启动子的lacZ报告基因上游,使lacZ基因的表达置于突变启动子下.获得的启动子融合表达质粒分别电转化入LM野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株Pl4a和prfa基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性以确定杂合突变启动子是否具有依赖PrfA的转录活性及其水平高低.结果 当肩动子上影响PrfA转录调控的两个核心元件PrfA-box与-10区的距离保持在最适的22或23个碱基时,交换PplcA和ParoA2上的两个相应核心元件的碱基序列并不改变启动子的转录活性.但是,当PplcA上的两个核心元件之间的碱基以及-10区下游的序列被相应ParoA2上的序列所替代后,PplcA依赖于PrfA的转录活性完全丧失,反之,ParoA2上的这两段序列如果被PplcA的序列所替换,ParoA2则表现出依赖于PrfA的转录活性.结论 ParoA2的-10区及其下游的序列可能形成发夹结构,阻碍RNA聚合酶-PrfA蛋白复合物结合到解旋的单链模板DNA上生成具有转录起始活性的开放复合物,从而抑制了ParoA2依赖于PrfA的转录活性的表达.     

新生隐球菌荚膜相关基因CAP10启动序列的活性研究

目的 筛选具启动活性的新生隐球菌荚膜相关基因CAP10编码区上游5’侧翼序列（启动子序列），为进一步研究其调控机制打下基础。方法 利用氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的编码基因为报告基因，构建了含不同长度的新生隐球菌荚膜相关基因CAP10编码区上游5’侧翼序列和报告基因的重组体，转化酵母，ELISA方法检测各转化子的CAT表达活性，并通过比较找到CAP10启动序列。结果 发现含CAP10编码区上游-303 bp、-390bp、-500bp、-951bp的转化子具有明显的CAT表达活性，而含-202bp、-102bp的转化子无明显的CAT表达活性。结论 CAP10上游5’侧翼端-303bp-0bp是具完整启动活性的最小单位。CAP10上游5’侧翼端-202bp--303bp内含CAP10启动所必需的序列。     

人BAFF-R基因启动子活性的初步研究

目的以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域。方法克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞,检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域。结果8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性最强,pGL3-B8启动子活性最低。结论BAFF-R基因5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域。     

hNaDC1基因5''''侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定

目的构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5’侧翼转录调控区不同长度片段:hNaDC1A(-2232/ 136,2368bp)、hNaDC1B(-1640/ 136,1776bp)、hNaDC1C(-1084/ 136,1221bp)、hNaDC1D(-253/ 136,389bp)、hNaDC1E(-2232/-12,2244bp),以pGL3-Basic为载体构建hNaDC1基因5’侧翼序列系列缺失质粒。重组体通过特异限制性内切酶酶切鉴定,并送样测序鉴定。结果成功构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体5个:pGL3-hNaDC1A～E。结论为进一步研究NaDC1基因5’侧翼区转录调控元件的分布特点及转录调控元件与转录因子间的相互作用提供了基本实验条件。     

5‘上游序列对TNFα诱导内皮细胞血小板源生长因子—B链基因…

目的和方法：为探讨人血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）－Ｂ链基因５‘上游序列在ＴＮＦα诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用,本研究将构建的一系列含人ＰＤＧＦ－Ｂ链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,与内参照质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌ共转染培养的人脐静脉内皮细胞,分别检测了不同浓度和不同持续时间ＴＮＦα作用下转染内皮细胞荧光素酶比活性,观察了５’上游序列的定向删切对ＴＮＦα诱导内皮细胞ＰＤＧＦ－Ｂ链基因转录的     

人支气管上皮细胞GCLC基因调控区ARE及E-box顺式调控元件调控功能的研究

目的 通过对人γ-谷氨酰半胱氨酸酶催化亚单位(GCLC)基因调控区的ARE及E-box顺式调控元件诱导缺失突变,研究它们在人支气管上皮细胞内对GCLC基因转录调控功能的影响.方法 应用PCR方法克隆人GCLC基因调控区的大部分核苷酸序列,构建表达虫荧光素酶报告基因的野生型质粒PL45.采用PCR重叠延伸产生特异位点诱变的方法对ARE及E-box顺式调控元件进行缺失突变,构建相应的突变型质粒PLdel-ARE及PLdel- E-box.通过瞬时基因转染方法将上述质粒转染人支气管上皮细胞系16HBE,观察基因突变后的基因转录调控功能.结果 质粒PL45的虫荧光素酶相对活性值为9949.75±1441.33、质粒PLdel-ARE的虫荧光素酶相对活性值为21258.75±1563.64、质粒PLdel-E-box的虫荧光素酶相对活性值为17082.00±89.51.与野生型质粒PL45相比,PLdel-ARE、PLdel-E-box突变型质粒表达的虫荧光酶相对活性值显著上升.结论 ARE及E-box顺式调控元件具有负性调控作用.     

N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍诱导共表达的蛋白基因启动子区的转录因子结合部位分析

目的：分析甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导的共表达蛋白的编码基因启动子区的转录因子结合部位。方法：用进化足迹法，结合转录因子数据库的搜索，预测共表达蛋白编码基因启动子区共有的转录因子结合部位。凝胶阻滞试验验证对于预测出的转录因子结合部位，在MNNG处理细胞中是否确实有相关转录因子的反应。结果：预测出11个共同存在于这些蛋白编码基因启动子区的转录因子结合部位，其中除已知转录因子激活蛋白1（activatorprotein1，AP1）在MNNG处理后被激活外，用凝胶阻滞试验又发现在MNNG处理细胞的核提取液中有2个转录因子——核因子Y（nuclear factor Y，NFY）和GATA结合因子（GATA-binding factor，GATA）的活性升高。结论：进化足迹法可以有效地降低转录因子结合部位预测结果中的假阳性率。NFY和GATA转录因子结合部位可能参与对MNNG诱导的共表达蛋白的共调控。