脂肪源性干细胞修复周围神经损伤潜能的研究

目的:体外原代培养脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC),并在细胞水平检测各种神经营养因子(neurotrophic factor,NF)的表达情况,探讨ADSC是否可以作为神经损伤修复的种子细胞。方法:体外原代培养和鉴定ADSC,应用RT-PCR方法检测ADSC细胞神经营养因子,包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin 3,NT-3);免疫组织化学法检测粘附因子(nerve cell adhesion molecule,NCAM)表达情况。结果:ADSC可以向脂肪和骨两方面分化;RT-PCR结果显示ADSC细胞NGF、BDNF、NT-3 mRNA水平明显升高;同时免疫荧光法检测到了高水平的NCAM。结论:ADSC具有干细胞分化潜能,并且能够表达NF和NCAM。     

脂肪源性干细胞促进大鼠受损坐骨神经传导及脊髓脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子的表达

目的:探讨脂肪源性干细胞(ADSCs)对坐骨神经损伤大鼠神经传导功能以及脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)表达的影响。方法:将第4代ADSCs移植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常组、杜氏改良Eagle培养基营养混合物F12(DMEM)组和ADSC组。DMEM组和ADSC组均建立坐骨神经损伤模型,后用相应的组织工程神经桥接损伤神经的断端。术后6周采用神经电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅,采用免疫荧光和Real-time PCR检测各组大鼠脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)蛋白和mRNA的表达。结果:ADSC组大鼠坐骨神经传导速度、波幅和脊髓BDNF和CNTF蛋白及mRNA表达均显著高于DMEM组。结论:ADSCs可增加坐骨神经传导速度和波幅、上调脊髓BDNF和CNTF的表达。     

丝胶对糖尿病大鼠坐骨神经及相关神经元胞体的保护作用

目的:探讨丝胶对Ⅱ型糖尿病大鼠坐骨神经及相关神经元胞体的保护作用,为防治糖尿病周围神经病变提供理论依据和实验基础.方法:雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组.采用免疫组织化学显色观察坐骨神经神经微丝蛋白(NFP),脊髓前角细胞、脊神经节细胞神经生长因子(NGF)和神经肽Y(NPY)蛋白的表达.结果:NFP免疫阳性产物为棕黄色,位于轴索;NGF蛋白免疫阳性产物为棕黄色细腻颗粒状,位于脊神经节细胞和脊髓前角细胞的胞质和胞核,以胞质为主;NPY蛋白免疫阳性产物为棕褐色颗粒状,位于脊神经节细胞和脊髓前角细胞的胞质.与正常对照组大鼠比较,糖尿病模型组大鼠坐骨神经NFP蛋白的表达、脊神经节细胞和脊髓前角细胞NGF蛋白的表达降低;脊神经节细胞和脊髓前角细胞NPY蛋白的表达增高.与糖尿病模型组大鼠比较,丝胶治疗组大鼠坐骨神经NFP蛋白的表达、脊神经节细胞和脊髓前角细胞NGF蛋白的表达增高;脊神经节细胞和脊髓前角细胞NPY蛋白的表达降低.结论:丝胶可通过上调Ⅱ型糖尿病大鼠坐骨神经NFP的表达、脊神经节细胞和脊髓前角细胞NGF蛋白的表达,下调糖尿病大鼠脊神经节细胞和脊髓前角细胞NPY蛋白的表达,发挥对Ⅱ型糖尿病大鼠坐骨神经及相关神经元胞体的保护作用.     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

脱细胞支架联合电针对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的保护作用

目的 :探讨脱细胞支架(AS)联合电针对坐骨神经损伤(SNI)大鼠脊髓前角运动神经元的保护作用。方法 :首先制备AS,用于桥接损伤的神经。其次切除大鼠右侧坐骨神经10 mm,建立大鼠SNI模型。将SNI模型大鼠随机分为模型组(M)、AS桥接组(AS)和AS联合电针治疗组(AST)。模型组不予任何干预,AS组将支架桥接于两断端处,AST组在支架桥接术后2 d给予电针进行治疗,采用20 Hz、1 mA疏密波相间的电流,针刺穴位为环跳和阳陵泉,每次电针15 min,7 d 1个疗程。电针4周后,用电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅,用尼氏染色观察各组大鼠脊髓前角运动神经元的形态结构,用免疫印迹检测各组大鼠脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)蛋白的表达。结果 :AST组大鼠坐骨神经传导速度和波幅明显高于AS组;尼氏染色显示AST组脊髓前角运动神经元胞体形态较完整,尼氏体呈蓝紫色、斑块状,偶见部分核移位现象,尼氏体的数量明显多于AS组和模型组;免疫印迹结果显示AST组脊髓内BDNF和NGF蛋白表达量均高于AS组和模型组。结论 :脱细胞支架联合电针不仅可增加大鼠坐骨神经传导速度及波幅,还可阻止脊髓前角运动神经元中尼氏体肿胀与溶解,并可上调脊髓内BDNF和NGF蛋白的表达,对SNI所致的脊髓前角运动神经元损伤有保护作用。     

超顺磁氧化铁标记对大鼠脂肪干细胞向肝样细胞诱导分化的影响

目的 研究超顺磁氧化铁(SPIO)标记对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向肝样细胞诱导分化的影响.方法 0.25％Ⅱ型胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,获取原代ADSCs.采用多聚赖氨酸(PLL)介导SPIO(25 μg/ml)标记ADSCs,以肝细胞生长因子(HGF)作为主要诱导因子,分成标记-诱导组、未标记-诱导组、标记-未诱导组及未标记-未诱导组,后2组分别作为对照.光学显微镜检测标记细胞内的铁摄取.台盼兰染色评价ADSCs的细胞活力.SPIO标记-诱导组和未标记-诱导组细胞均向肝样细胞诱导分化.分别在诱导前、诱导后7、14、21d糖原染色分析肝样细胞内糖原储存;免疫细胞化学染色和RT-PCR分析肝样细胞内白蛋白(ALB)的表达.结果 ADSCs胞浆内铁标记率为100％.SPIO标记组与未标记组的细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05).标记诱导组与未标记诱导组在诱导后14d细胞胞浆糖原染色均为阳性;诱导21d后,2组细胞胞浆内染色阳性的细胞增多.14、21 d ALB mRNA和蛋白表达水平逐渐增强.结论 SPIO标记对大鼠ADSCs的生长及其向肝样细胞诱导分化无明显影响.     

人参皂苷Rb1促进小鼠坐骨神经损伤修复的作用及机制研究

目的 构建小鼠坐骨神经损伤（SNI）模型,探讨人参皂苷Rb1对小鼠坐骨神经损伤修复的促进作用及机制。 方法 选取成年雄性昆明小鼠78只,随机分为假手术组（26只）、模型组（26只）、治疗组（26只）。模型制作采用钳夹损伤法,假手术组仅游离坐骨神经。模型制作后30 min,治疗组腹腔注射10 mg/kg人参皂苷Rb1,模型组与假手术组给予同等体积的生理盐水。采用坐骨神经功能指数（SFI）对小鼠坐骨神经功能进行追踪评价;利用HE染色及生长相关蛋白43(GAP43)免疫荧光染色检测损伤14 d后坐骨神经再生修复情况;利用透射电子显微镜观察损伤节段髓鞘的结构改变。损伤后14 d,检测脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)mRNA水平的表达变化。模型制作后3 d、7 d,利用Ki67、S100β免疫荧光染色检测施万细胞的增殖、迁移能力;利用Real-time PCR检测炎症相关因子以及施万细胞激活相关转录因子mRNA表达水平;通过Western blotting对Sox10在蛋白水平的变化进行验证。 结果 治疗组SFI评分高于模型组小鼠,神经近端、远端HE染色较均一。透射电子显微镜提示,治疗组髓鞘结构、厚度较模型组明显改善,髓鞘内神经纤维排列较为整齐。免疫荧光染色结果显示,治疗组坐骨神经GAP43+轴突伸长明显优于模型组,BDNF、NGF等营养因子表达升高。进一步检测发现,给予Rb1后损伤节段附近Ki67+细胞增殖、S100β+施万细胞迁移明显增多。Real-time PCR结果显示,治疗组肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β mRNA表达水平明显下降,施万细胞激活相关转录因子表达水平上升。 结论 10 mg/kg Rb1能降低再生组织环境中炎症因子表达水平,增加BDNF、NGF等营养因子的表达水平,促进施万细胞激活,从而促进小鼠坐骨神经损伤后的神经再生。     

NGF过表达对大鼠脑缺血再灌注损伤模型认知功能的影响

目的探究神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达对大鼠脑缺血再灌注损伤模型认知功能的影响。方法将SD大鼠分成空白对照组、模型组和NGF转染组。水迷宫实验检测各组大鼠学习能力,荧光定量PCR,Western blot和免疫组织化学染色检测NGF和Caspase-3的相对表达水平,免疫荧光染色定位NGF蛋白的表达,尼氏染色和透射电镜观察神经元细胞的数量以及血脑屏障的完整性。结果 NGF转染组逃避潜伏期时间要明显短于模型组,而穿越平台次数明显多于模型组。NGF转染组NGF蛋白和mRNA相对表达量明显高于模型组,Caspase-3蛋白和mRNA相对表达量明显低于模型组。NGF蛋白与神经元细胞标记蛋白NSE可共染,而与神经胶质细胞标志物GFAP不可共染。NGF转染组细胞数明显多于模型组细胞数。模型组细胞轮廓模糊,血脑屏障破坏,而NGF转染组细胞轮廓存在,血脑屏障破坏较小。结论 NGF的过表达促进神经元细胞的存活,对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的认知功能有保护作用。     

小分子化合物诱导大鼠脂肪基质干细胞向神经元的分化

目的:探讨小分子化合物诱导大鼠脂肪基质干细胞(ADSCs)向神经元的分化。方法:用Trichostatin A(TSA)、RG-108、8-BrcAMP和Rolipram 4种小分子物质对SD大鼠的ADSCs进行诱导分化,用免疫荧光形态学、免疫印迹和qRT-PCR等方法分别检测诱导前、后ADSCs神经元标志的表达。结果:诱导7 d时,ADSCs呈明显的神经元样结构,胞体呈圆形,具有多个突起,神经元样形态变化率高达95.12%±2.65%;诱导后的ADSCs nestin、β-tubulinⅢ、MAP2和ChAT在mRNA和蛋白水平的表达均有升高。结论:小分子化合物可将ADSCs诱导分化为神经元样细胞,其可作为治疗神经系统疾病及损伤的干细胞移植的种子细胞。     

ChABC联合脂肪源性干细胞对大鼠脱细胞异体神经支架移植后功能恢复的影响

目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)与脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)联合应用对脱细胞异体神经支架移植修复坐骨神经缺损后大鼠运动和感觉功能恢复的影响。方法:成年大鼠随机分为脱细胞坐骨神经(acellular rat sciatic nerve,ARSN)组、ChABC组、ADSC组、ChABC+ADSC组;应用坐骨神经功能指数(SFI)、电生理和胫前肌湿重比检测神经再生和运动功能的恢复;脊神经节HRP逆行标记及患侧足掌皮肤触觉小体HE染色检测感觉功能的恢复。结果:与ARSN组比较,ChABC组、ADSC组和ChABC+ADSC组SFI显著增高,神经传导速度显著增高,动作电位波幅增大,胫前肌湿重比率增高,HRP阳性标记感觉神经元和触觉小体的数量增高(P<0.05)。其中ChABC+ADSC组作用显著优于单独治疗组(P<0.05)。结论:ChABC联合ADSC移植对大鼠坐骨神经缺损脱细胞异体神经支架修复后运动和感觉功能恢复的作用优于单独治疗组。     

VEGF和HIF-1在糖尿病大鼠坐骨神经的表达及NGF的调节作用

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)及缺氧诱导因子-1(H IF-1)在糖尿病周围神经病变中的表达及神经生长因子的调节作用。方法大鼠糖尿病造模后分成糖尿病(DM)组及神经生长因子(NGF)治疗组,治疗2周后采用蛋白印迹及免疫组化法观察坐骨神经VEGF及H IF-1动态变化。结果蛋白印迹显示正常组坐骨神经纤维无VEGF和H IF-1表达,DM组VEGF及H IF-1表达呈阳性,NGF治疗组无表达。免疫组织化学结果显示,坐骨神经VEGF阳性产物位于轴突及雪旺氏细胞中,DM组积分光密度明显高于正常组及NGF组(P<0.01)。结论局部应用外源性NGF减少糖尿病大鼠坐骨神经VEGF和H IF-1的表达。     

联合应用神经生长因子和神经节苷脂1对坐骨神经损伤大鼠脊髓神经元的保护作用

目的：了解联合应用神经生长因子(NGF)和神经节苷脂1(GMl)对大鼠周围神经损伤后脊髓神经元的保护作用。方法：选用SD大鼠,分为生理盐水(NS)组、NGF组、GM1组和NGF GM1组,将大鼠坐骨神经造成5mm缺损,术中硅胶管内局部加药、术后大鼠损伤侧小腿肌注药物。术后定期光、电镜观察L4～I6脊髓前角神经元结构变化,测定损伤远段和近段神经传导速度。结果：脊髓运动神经元数目以及神经传导速度4周时,NGF组和GM1组均多于或快于NS组,NGF GM1组则多于或快于NS组、NGF组和GM1组,8周时NGF GM1组、NGF组、GM1组组间无显著性差异但均多于或快于NS组。结论：NGF GM1对周围神经损伤后脊髓运动神经元退变的保护作用与单用NGF或GM1相比,能更早期地发挥作用,并且效果优于单用NGF或GM1。     

Intracranial transplantation of human adipose-derived stem cells promotes the expression of neurotrophic factors and nerve repair in rats of cerebral ischemia-reperfusion injury

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) are of great interest as a cellular therapeutic agent for regenerative and immunomodulatory purposes. The aim of this study was to investigate whether ADSCs transplantation could promote nerve repair in rats of cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury. We isolated and cultured human ADSCs, and then measured cell surface antigens by flow cytometry and immunofluorescence. Healthy SD rats were randomly divided into sham group, MCAO group, MCAO+vehicle group and MCAO+ADSCs group. Cerebral ischemia-reperfusion injury was induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Then the human ADSCs were transplanted into the brain of rats 24 h after MCAO. The mRNA level of BDNF (brain derived neurotrophic factor, BDNF), NGF (nerve growth factor, NGF) and bFGF (basic fibroblasts growth factor, bFGF) were detected by real-time PCR at different time points (d7, d14, d21 and d28 after MCAO). Meanwhile, the neurological deficit scores were estimated. The neurological deficit of rats in MCAO+ADSCs group attenuated at d7 in contrast to the MCAO+vehicle group (P<0.05). Subsequently, they were dramatically ameliorated with the time especially at d28. At d7, d14, d21 and d28 after ADSCs transplantation, BDNF, NGF and bFGF mRNA in MCAO+ADSCs group were strikingly higher than those in MCAO+vehicle group, and these two groups both reached the peak at d14. The western blotting results showed that BDNF and Bcl-2 expressed higher in MCAO+ADSCs group than MCAO+vehicle group. Therefore, our current results suggest that ADSCs promote nerve repair after injury through elevating the expression of neurotrophic factors and inhibiting the apoptosis of neural cells.     

脂肪源性干细胞移植对糖尿病周围神经病大鼠坐骨神经TNF-α和MBP表达的影响

目的研究脂肪源性干细胞(ADSC)移植对糖尿病周围神经病(DPN)大鼠坐骨神经中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达的影响。方法大鼠随机分为正常组、模型组和ADSC组。链脲佐菌素腹腔注射制备实验DPN大鼠模型,ADSC组尾静脉注射ADSC细胞悬液,造模后14 d检测各组血糖及坐骨神经传导速度,实时荧光定量PCR检测坐骨神经TNF-α和MBP mRNA表达。结果与正常组比较,模型组和ADSC组血糖显著增高,神经传导速度显著降低,坐骨神经TNF-α和MBP mRNA表达显著上调。与模型组比较,ADSC组神经传导速度显著增高,坐骨神经TNF-α和MBP mRNA表达显著下降。结论脂肪源性干细胞下调糖尿病周围神经病坐骨神经TNF-α和MBP mRNA表达。     

Neurotrophins and other growth factors in the regenerative milieu of proximal nerve stump tips

Classic ideas on mechanisms for axon sprouting and nerve regeneration from peripheral nerves suggest that there is a prominent role for neurotrophin support. There has been comparatively less attention towards features of the regenerative process that develop from the proximal nerve trunk without the support of target tissues or the denervated trunk of a peripheral nerve. We studied early (2–14 d) expression of local growth factors in proximal nerve stump tips of transected sciatic nerves in rats. Immunohistochemical labelling was used to address specific deposition of BDNF, NGF, NT-3, bFGF, CNTF and IGF-1. We observed a unique localisation of BDNF, and to a much lesser extent, NGF in mast cells of injured nerve trunks but they were also observed in intact uninjured nerves. Macrophages did not express either BDNF or NGF. CNTF and IGF-1 were expressed in Schwann cells of intact nerves and stumps. We did not observe bFGF or NT-3 expression in any of the samples we studied. Mast cells may represent an important reservoir of BDNF in peripheral nerves.     

大鼠坐骨神经固有频率测定

目的:确定实验大鼠坐骨神经的固有频率，观察不同状态下神经固有频率的变化，为神经再生修复研究中康复治疗仪器的频率选择提供参考。方法:将18只SD大鼠随机分为正常组、SNI 7 d组、SNI 28 d组，每组各6只，正常组不予干预，模型组行坐骨神经钳夹伤术。于造模后第7天通过振动平台对正常组、正常组的离体神经（即离体组）、SNI 7 d组，以及造模后第28天对SNI 28 d组大鼠施加振动频率源，在振动响应检测模块测得的数据基础上，根据频率特性曲线确定大鼠坐骨神经固有频率。结果:正常组、离体组、SNI 7 d组、SNI 28 d组大鼠坐骨神经频率特异性曲线均显示单一峰值；组间固有频率比较差异均无统计学意义（P=0.156）；组间两两比较显示，正常组与离体组、SNI 7 d组、SNI 28 d组比较，SNI 7 d组与SNI 28 d组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。固有频率检测值总体均数为9.635 Hz。结论:实验大鼠坐骨神经固有频率约为9.635 Hz，且固有频率是相对稳定的，不会因其所处状态不同而发生较大变化。     

BDNF在大鼠脊髓压迫性损伤脱髓鞘病变中的作用

目的　观察脊髓压迫性损伤后脑源性神经生长因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表达变化与有髓神经纤维脱髓鞘病变之间的关系,以阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变的作用。 方法　SD雄性大鼠60只,将其均分成3 组：模型组、假手术组和正常组,用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。模型组作脊髓压迫24 h, 假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。锇酸和LFB(luxol fast blue) 染色观察有髓神经纤维变化情况; Western blot检测髓鞘碱性蛋白( myelin basic protein,MBP)和BDNF的表达。 结果　24 h后,与假手术组比较,模型组压迫前段(T11)有髓神经纤维无明显肿胀和数量变化,MBP表达未见变化（P>0.05）,但BDNF的表达量升高(P<0.05);而压迫段（T12）和压迫后段（L1）有髓神经纤维肿胀并伴有数量降低(P<0.05), BDNF和MBP的表达量也随之下降(P<0.05),且压迫段（T12）脱髓鞘病变更为严重,BDNF降低也更为明显(P<0.01)。 结论　大鼠脊髓压迫性损伤BDNF表达减少可导致脊髓脱髓鞘病变的发生,而BDNF表达量升高可能对脊髓脱髓鞘病变具有保护作用。     

Tissue-engineered peripheral nerve grafting by differentiated bone marrow stromal cells

Bone marrow stromal cells are multipotential stem cells that contribute to the differentiation of tissues such as bone, cartilage, fat and muscle. In the experiment, we found that bone marrow stromal cells can be induced to differentiate into cells expressing characteristic markers of Schwann cells, such as S-100 and glial fibrillary acidic protein, promoting peripheral nerve regeneration. Tissue-engineered bioartificial nerve grafting of rats by differentiated bone marrow stromal cells was applied for bridging a 10 mm-long sciatic nerve defect. Twenty-eight inbred strains of female F344 rats weighing 160 approximately 200 g were randomly divided into four nerve grafting groups, with seven rats in each group. Differentiated bone marrow stromal cell-laden group: poly(lactic-co-glycolic) acid tubes with an intrinsic framework were seeded with syngeneic bone marrow stromal cells which were induced for 5 days; Schwann cell-laden group: poly(lactic-co-glycolic) acid tubes with an intrinsic framework were seeded with syngeneic Schwann cells; acellular group: poly(lactic-co-glycolic) acid tubes were only filled with an intrinsic framework; autografts group. Three months later, a series of examinations was performed, including electrophysiological methods, walking track analysis, immunohistological staining of nerves, immunostaining of S-100 and neurofilament, and axon counts. The outcome indicated that bone marrow stromal cells are able to differentiate into Schwann-like cells and Schwann-like cells could promote nerve regeneration. Bone marrow stromal cells may be potentially optional seed cells for peripheral nerve tissue engineering because of abilities of promoting axonal regeneration.