长链游离脂肪酸对滋养细胞线粒体三羟基酰基辅酶A脱氢酶基因启动子区甲基化程度的影响

目的 探讨长链游离脂肪酸对胎盘滋养细胞线粒体β氧化循环长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)基因启动子区甲基化程度影响,以及对甲基化修饰的时间效应.方法 体外培养原代人绒毛滋养细胞及HTR-8/SVneo永久性人滋养细胞,研究组采用长链游离脂肪酸孵育滋养细胞(LC-FFA组),并以短链游离脂肪酸(SC-FFA组)和中链游离脂肪酸(MC-FFA组)作为不同链长游离脂肪酸对照组,空白对照组无脂肪酸(F-FFA组).分别在孵育24、48及72 h收集细胞并提取DNA.在LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp区域内序列预测CpG岛位置,设计甲基化检测位点和引物.采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测不同组CpG岛各CpG位点的甲基化程度后进行各甲基化位点和CpG岛的统计学分析.结果 (1)在LCHAD基因转录起始位点上游2 000bp区域内的17个CpG位点中获得11个位点(65％)的甲基化程度,8个为单独位点,3个为复合位点(-984、-960、-899、-853、-811、-796、-774、-727、-615、-595、-579).在不同研究组中每个位点的甲基化变化程度各不同,其中-899位点变化最明显.(2)LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度变化分析:①长、中链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势:LC-FFA组孵育72 h(0.55±0.08)比孵育48 h(0.35±0.12)及24 h(0.31±0.04)均明显升高(P＜0.05),48 h虽比24 h升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).MC-FFA组孵育72 h(0.44±0.05)比孵育24 h(0.31±0.04)明显升高(P＜0.05).②不同链长游离脂肪酸在不同作用时间影响LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度比较:LC-FFA组孵育72 h的甲基化程度比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).(3)作用72 h游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区11个CpG位点甲基化程度影响比较:在LC-FFA组和MC-FFA组-899位点甲基化程度明显高于其他位点(P＜0.05).(4)长链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区-899位点甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势(P＜0.05).LC-FFA组孵育72 h比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).结论 长链游离脂肪酸比中链和短链游离脂肪酸呈现较大的滋养细胞LCHAD基因启动子区甲基化的修饰作用,并伴随作用时间延长表现出明显的时间依赖效应;甲基化程度改变主要发生在LCHAD基因启动子区-899位点.

Study on the methylation of LCHAD gene promoter region in mitochondria of trophoblast cells incubated with long-chain fatty acids