动态力学加载下MC3T3-E1细胞在3D打印三维仿生复合支架上的成骨效应研究

目的观察动态力学加载对低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内MC3T3-E1细胞增殖、分化、成骨特异性基因表达的影响。方法将丝素蛋白、Ⅰ型胶原、羟基磷灰石按质量比3∶9∶2混合后,采用低温3D打印联合冷冻干燥技术制备三维仿生复合支架;大体观察支架外形,Micro-CT观察支架孔径及孔隙率,测定吸水膨胀率以及应力、应变、弹性模量。取MC3T3-E1细胞接种至三维仿生复合支架,随机分成两组:实验组培养期间行动态力学加载,每天1次、每次15 min、频率1 Hz、应变3 500με;对照组不作力学加载。培养7、14 d,分别对细胞-支架复合物行HE染色及扫描电镜观察细胞在支架上生长情况;Western blot以及实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原、BMP-2、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白及m RNA表达。结果制备的三维仿生复合支架为白色立方体网格,Micro-CT检测见支架材料内部呈孔隙网状结构,孔隙连通性良好;大孔径直径为(506.37±18.63)μm,微孔径直径为(62.14±17.35)μm,孔隙率为97.70%±1.37%,吸水膨胀率为1 341.97%±64.41%。力学测试示,支架压缩至10%时,支架压缩位移为(0.376±0.004)mm、压缩应力为(0.016±0.002)MPa、弹性模量为(162.418±18.754)k Pa。复合培养7、14 d,两组HE染色及扫描电镜均见细胞在支架内部生长,主要分布在支架孔壁周围,其中实验组细胞较对照组增多,且细胞由梭形变为扁平状。除200倍镜下14 d时两组细胞计数差异无统计学意义(t=–2.024,P=0.080)外,其余不同放大倍数(40、100、400倍)下各时间点实验组细胞数均显著高于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示:实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、OCN m RNA相对表达量显著高于对照组(P0.05),但BMP-2 m RNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、BMP-2、OCN蛋白相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。结论动态力学加载后,接种于三维仿生复合支架的MC3T3-E1细胞BMP-2、Ⅰ型胶原、OCN表达明显上调,表明适当力学载荷有利于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。